富马酸替诺福韦二吡呋酯中残留溶剂检测方法的建立及验证

孙 伶，刘 川，刘晓莉，张伟丽（.石家庄四药有限公司，河北石家庄 0565；.石家庄市急救中心）

技术方法

富马酸替诺福韦二吡呋酯中残留溶剂检测方法的建立及验证

孙 伶1，刘 川1，刘晓莉2，张伟丽1
（1.石家庄四药有限公司，河北石家庄 052165；2.石家庄市急救中心）

富马酸替诺福韦二吡呋酯；顶空气相色谱法；残留溶剂；方法验证

富马酸替诺福韦二吡呋酯化学名为9-［（R）-2-［［双［［（异丙氧基羰基）氧基］甲氧基］氧膦基］甲氧基］-丙基］腺嘌呤富马酸盐（1：1），是美国Gilead 公司开发的一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，于2002 年在欧盟上市，用于治疗HIV-1感染和慢性乙型肝炎［1］，其活性成分替诺福韦为无环的5’-单磷酸腺苷类似物，在体内被细胞激酶磷酸化生成替诺福韦二磷酸，通过与5’-三磷酸脱氧腺苷酸竞争参与到病毒DNA链的合成中，导致DNA链延长受阻而抑制病毒的复制［2］。酯化的替诺福韦口服吸收率明显提高，并能提高细胞对其摄取。

药物中的残留溶剂是指在原料药或辅料的生产及制剂制备过程中使用或产生的，在后续工艺中未能完全去除的有机溶剂。这些有机溶剂的使用对药物的产率、晶型以及溶解度等产生重要影响，但在药物中的残留不仅没有药效作用，而且潜在毒性还会对服药者的健康造成危害［3-4］。因此，在人用药品注册技术上，国际协调会（ICH） 对残留溶剂的种类和限度做了明确规定［5］。为了保障人们用药安全，对药物中残留溶剂进行有效控制十分重要。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 岛津2010plus气相色谱仪，配氢火焰离子化检测器（ 日本岛津公司）；TubroMatrix40顶空进样器，配20ml样品瓶（PE公司）；SPH-500高纯氢气发生器，SPB-3空气发生器（北京中惠普分析技术研究所）。富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药购自上海遐瑞医药科技有限公司；异丙醇、二氯甲烷及乙酸乙酯均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇购自美国默克公司；异丙醇、二氯甲烷及乙酸乙酯均为高效液相色谱纯；甲醇为气相顶空专用溶剂。

1.2 色谱条件 DB-624石英毛细管柱（30m×0.32mm× 1.8μm，美国Agilent公司）。载气为高纯氮气，柱内流速3.0ml/min，隔垫吹扫气流速3.0ml/min。采用分流进样，分流比为20：1，进样口温度200℃，检测器温度250℃。程序升温：40℃保持20min，5℃/min 的速率升温至200℃，维持10min。

1.3 顶空条件 平衡温度90℃，传输管温度100℃，进样环温度110℃；平衡时间30min，加压时间10s，充样时间7s，进样时间15s；顶空进样体积1ml。

1.4 供试品溶液及对照品溶液的配制

1.4.1 供试品溶液：分别精密称取不同批次的富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药500mg，置于20ml顶空瓶中，精密加入5ml甲醇溶解，密封，制得含富马酸替诺福韦二吡呋酯100mg/ml的供试品溶液，于室温条件下保存，此时原料药完全溶解并且性质稳定。

1.4.2 对照品溶液： 精密称取500mg异丙醇、60mg二氯甲烷、500mg乙酸乙酯于100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别制得每毫升含5mg异丙醇、0.6mg二氯甲烷、5mg乙酸乙酯的标准储备液。将该储备液用甲醇稀释10倍，即制得相对于100mg/ml供试品溶液的浓度换算成相当于药典规定的各个残留溶剂浓度限度的溶液，将此溶液作为100%对照品。同样逐级稀释储备液制得150%、120%、80%、50%、30%、10%、5%对照品溶液。

1.5 分析方法的建立

1.5.1 溶剂选择：原料药易溶于甲醇及N，N-二甲基甲酰胺，微溶于水，参考2010年版中国药典二部附录Ⅷ P残留溶剂测定，初步确定甲醇做为供试品溶液配制的溶剂。

1.5.2 检测条件选择：参照中国药典2010年版二部附录ⅧP残留溶剂测定法建立检测方法，结合3种残留溶剂的物理性质与极性，依据安捷伦公司网站中的DB-624色谱柱标准图谱，采用中等极性毛细管柱顶空进样检测。

1.5.3 样品平衡温度的考察：样品平衡温度影响检测灵敏度，温度越高，蒸汽压越高，顶空气体的浓度越高，分析的灵敏度将会提高，但过高的温度可能引起供试品热分解以及样品体系的不稳定，所以需要对平衡温度进行考察。实验中以100%对照品为测试液，分别考察80℃、90℃与100℃的平衡温度对各组分测定的影响。在上述过程中每个温度条件下，样品平衡时间均维持30min，顶空进样器的定量环、样品传输线的设定分别比相应平衡温度高10℃。比较平衡温度为90℃与平衡温度为80℃，3种残留溶剂的检测灵敏度均有较大提高，当平衡温度为100℃时，异丙醇的灵敏度降低，其他两种溶剂的灵敏度增长亦不明显，综合分析，选择90℃作为样品的平衡温度。见表1：

表1 平衡温度选择试验结果

1.5.4 样品平衡时间的选择：样品平衡时间过短会导致样品溶液的气-液两相达不到平衡，使进样的重复性变差，影响准确定量；过长则会使分析时间变长，降低分析速度，因此需对顶空的平衡时间进行考察。以100%对照品溶液为测试液，在最佳平衡温度90℃条件下，分别考察了平衡时间为20min、30min与40min时样品的平衡情况。当平衡时间为30min时比平衡温度为20min时3种残留溶剂的检测灵敏度均有较大提高，当平衡时间增加为40min时，3种溶剂的灵敏度增长均不明显，综合分析，选择最佳平衡时间为30 min。见表2：

表2 平衡时间选择试验结果

2 结果与分析

2.1 专属性试验 分别考察了样品溶剂甲醇、异丙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯相互间准确定量的干扰情况，从试验结果看，甲醇、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯依次出峰，甲醇和3种残留溶剂的色谱峰在各自出峰时间处不产生相互干扰，同时各组分也不含有干扰其他组分测定的杂质峰，说明本方法合理可行。

2.2 检出限、定量下限与线性范围 通过将低浓度的对照品溶液逐级稀释顶空进样，将色谱峰高为信噪比3倍时对应的浓度作为检出限，峰高为信噪比10倍时对应的浓度为定量限；将5%-150%对照品溶液按浓度从低到高进行测定，以浓度（X，mg/ml）为横坐标，以平均峰面积（Y，μV・s）为纵坐标进行线性回归，得到3种溶剂的线性方程及相关系数（见表3）。结果显示，异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯的检出限为依次为0.53、0.08、0.25（10☒g/ml），根据对应的100mg/ml的供试品浓度，分别换算成药物质量的0.0005%、0.00007%、0.0003%。3种残留溶剂的检出限均小于2010年版中国药典规定的浓度限度0.5%、0.06%、0.5%。3种溶剂在各自的定量限与150%浓度限度范围内，线性相关系数均大于0. 995。表明采用外标曲线法可实现对药物中溶剂残留量的准确定量。

表3 3种溶剂的检出限、定量下限、线性方程、线性范围及相关系数

2.3 精密度与准确度试验 将100%对照品溶液连续6次平行顶空进样测定，记录各组分的峰面积，计算相对标准偏差（RSD）。得到异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯峰面积的RSD分别为1.5%、1.9%、0.6%，均小于药物质量控制方法研究中关于精密度实验峰面积RSD（n=6）不大于5.0%的规定，表明本方法精密度良好。采用标准加入法，依次向准确称取的500mg富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药中分别添加5ml 80%、100%、120%的对照品溶液，每个浓度的对照品溶液配制3个样品，在选定的色谱条件下，进行测定，分别计算各组分的平均回收率及相对标准偏差（RSD）。试验结果表明，3种溶剂的平均回收率为99%-101.0%，RSD（n=9）均不大于2.4%，可满足准确度实验平均回收率在90%-110%范围内、RSD（n=9）小于5.0%的规定，表明本方法准确度良好。

2.4 溶液稳定性试验 原料药溶于甲醇制成一定溶度的溶液后，溶液的稳定性直接影响到检测方法的准确性，故应进行溶液稳定性试验。取供试品溶液于室温放置，分别于0、1、2、4、8、12h取样检测，记录各组分的峰面积，计算相对标准偏差（RSD）。得到异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯峰面积的RSD分别为0.5%、0.4%、0.9%，均小于1.0%，满足溶液稳定性的要求，表明本方法中供试品溶液于12h内稳定。

3 讨论

本文建立了测定富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药中残留溶剂异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯的顶空气相色谱方法，并对溶剂、检测条件、平衡温度、平衡时间等条件进行了选择及优化。通过条件优化，最终确立了以DB-624 为分析柱、90℃为平衡温度、30min为平衡时间的分析方法。经过方法学验证，该方法的专属性、检出限、线性相关性、重复性、准确度等各项指标均可满足药物质量控制的方法学要求，所建立的分析方法能够对富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药中的残留溶剂达到有效监控，可以作为企业产品研发与生产的质控方法，同时本方法也能够对其他类似残留溶剂的检测工作提供参考，具有广泛的实用性。

［1］Michailidis E，Kirby KA，Hachiya A，et al.Antiviral therapies：focus on hepatitis B reverse transcriptase［J］.Int J BiochemCell B，2012，44（ 7） ： 1060-1071.

［2］Fung HB，Stone EA，Piacenti FJ.Tenofovir disoproxil fumarate：a nucleotide reverse transcriptase inhibitor for the treatment of HIV infection［J］.Clin Ther，2002，24（10） ： 1515-1548.

［3］谭瑞，杨俊卿，颜波，等.中国西部健康人群口服替诺福韦富马酸酯片的药动学研究［J］.中国药房，2011，22（22）：2048-2050.

［4］文爱东，吴寅，杨春娥，等.富马酸替诺福韦酯胶囊与片剂的人体生物等效性研究［J］.中国新药杂志，2007，16（4）：324-327.

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1004-6879（2015）02-0142-03

2014-10-14）