侧脑室微量注射瘦素对大鼠下丘脑GnIH表达的影响*

魏 萌，武 俭，苏 玮，杨松鹤，程露阳，乔跃兵（承德医学院，河北承德 067000）

基础医学

侧脑室微量注射瘦素对大鼠下丘脑GnIH表达的影响*

魏 萌，武 俭，苏 玮，杨松鹤，程露阳，乔跃兵△
（承德医学院，河北承德 067000）

目的：探讨侧脑室微量注射瘦素对下丘脑促性腺激素抑制激素（GnIH）蛋白表达的影响。方法：10只雌性Wistar大鼠随机分为注射生理盐水6h组和注射瘦素6h组，每组5只大鼠。大鼠去卵巢手术同时给予17β-雌二醇后，分别于侧脑室微量注射生理盐水和瘦素各4μl。采用蛋白印迹技术检测下丘脑GnIH蛋白表达的变化。结果：与注射生理盐水6h组相比，微量注射瘦素可明显降低下丘脑GnIH的表达水平（P＜0.05）。结论：瘦素可能通过抑制GnIH的表达发挥对下丘脑-垂体-性腺轴的调节作用。

侧脑室；瘦素；GnIH；下丘脑-垂体-性腺轴

生殖功能是包括人类在内的各种物种得以繁衍的基础，而下丘脑-垂体-性腺轴是调控生殖功能的极为微妙且复杂的系统之一。下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）是下丘脑中唯一能控制垂体促性腺素释放的调节激素，可刺激甾体类激素的合成，促进精子和卵子发生［1］。目前，已知瘦素（Leptin）可通过下丘脑-垂体-性腺轴对GnRH的释放进行调节，但具体机制尚不完全明了［2］。促性腺激素抑制激素（GnIH）是脊椎动物体内能抑制GnRH分泌的下丘脑神经肽。目前，GnIH神经元是否是Leptin调节GnRH分泌的多个途径中的一员，国内尚无此方面的报道。本研究旨在探讨大鼠侧脑室微量注射Leptin是否可影响下丘脑GnIH蛋白的表达，为探讨Leptin是否能通过GnIH神经元发挥对下丘脑-垂体-性腺轴的调节作用提供必要的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 10只成年健康雌性Wsitar大鼠（北京维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK（京）2012-0001）行双侧卵巢摘除术，术后第15d开始项背部皮下注射17β-雌二醇（0.1mg/kg/d）连续5d，以建立卵巢摘除术补充雌激素（OEP）大鼠模型。所有OEP模型大鼠随机分为2组，注射生理盐水6h组（5只）、注射Leptin 6h组（5只）。根据George Paxinos的方法定位侧脑室：前囟点后1.0mm，旁开1.5mm，进针深度4.4mm。注射Leptin组和注射生理盐水组大鼠分别向侧脑室微量注射Leptin（PeproTech公司）和生理盐水各4μl，于5min内注射完毕。

1.2 蛋白样品制备和Western blot分析 两组大鼠分别微量注射Leptin和生理盐水后6h处死，迅速取出下丘脑称重，加入裂解液后提取总蛋白，总蛋白含量用蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）测定，电泳时蛋白上样量120μg。经SDS-PAGE（12%分离胶，4%堆积胶）分离的蛋白电转移（150mA，1.5h）至PVDF膜（Millipore）上，含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液室温封闭1h，一抗［兔抗GnIH多克隆抗体（1：1000，Santa Cruz公司），小鼠抗β-actin单克隆抗体（1：1000，Abcam公司）］4℃孵育过夜，二抗［分别为（HRP）结合的羊抗兔IgG（1：1000，Pierce公司）和羊抗小鼠IgG（1：1000，Pierce公司）］孵育1h，洗膜5次后，化学发光法显色。图像扫描后采用Quantity One 4.62分析软件分析条带的平均灰度值，以目的条带灰度值与对应β-actin条带灰度值之比作为GnIH蛋白表达量的相对水平。

1.3 统计分析 各项实验至少重复3次。实验数据以均值±标准差（±s）表示，采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

侧脑室微量注射Leptin对大鼠下丘脑GnIH蛋白表达的影响：注射Leptin 6h组大鼠下丘脑GnIH蛋白的表达水平为（0.63±0.08），明显低于注射生理盐水6h组大鼠下丘脑GnIH蛋白的表达水平（1.32±0.22，P＜0.05）。见附图。

附图 大鼠下丘脑GnIH蛋白的表达水平

3 讨论

Leptin在调节摄食、控制能量平衡及生殖功能等多方面发挥重要作用，长期以来都是研究人员关注的焦点之一。其中人和动物的生殖功能受下丘脑弓状核（ARC）及腹内侧核（VMN）等部位的调节，Leptin可作用于下丘脑影响GnRH的分泌。但迄今为止，研究人员没有在GnRH神经元上发现瘦素受体（Ob-R），说明瘦素不能直接作用于GnRH神经元，只能通过其它途径间接发挥作用［3］。已经明确的是，Leptin可以通过神经肽Y（NPY）/刺鼠相关蛋白（AgRP）、阿片促黑激素皮质素原（POMC）、亲吻素（Kiss 1）等神经元对下丘脑-垂体-性腺轴进行调节。最近的一项研究发现，敲除小鼠Kiss 1神经元上的Ob-R，并不影响小鼠青春期的启动和生育，提示在Leptin对GnRH的调节中，还有可能存在其它途径［2］。

2000年，Tsutsui等发现了一个能抑制GnRH释放的下丘脑神经肽，命名为GnIH，它存在于包括哺乳动物、鸟类、两栖动物和鱼等多种生物的体内［4-8］。哺乳动物GnIH神经元主要位于下丘脑的室周核、背内侧核以及背内侧核与下丘脑腹内侧核之间的区域［5］。体内外给予GnIH可通过垂体抑制哺乳动物和鹌鹑黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的分泌［9-10］。2012年，研究人员发现哺乳动物GnRH1神经元上表达GnIH-R，明确证明GnIH可通过直接作用于GnRH1神经元抑制生殖功能［6］。

本课题组前期研究已经证明，OEP大鼠侧脑室微量注射Leptin后，血中GnRH、LH、FSH水平呈升高-降低-正常水平的波动性变化，提示Leptin可通过作用于上游神经元来发挥作用。在Leptin影响血中GnRH、LH、FSH水平这一过程中，GnIH是否发挥了作用，Leptin是否可通过调节GnIH神经元作用于GnRH神经元从而发挥对下丘脑-垂体-性腺轴的调节作用还不明了。本研究采用蛋白印迹技术观察了侧脑室微量注射Leptin 6h后，OEP大鼠下丘脑GnIH蛋白的表达情况，结果显示侧脑室注射Leptin可明显降低下丘脑GnIH的表达水平。由此，本研究提出Leptin可能通过抑制GnIH的释放来实现对下丘脑-垂体-性腺轴的调节；Leptin除了通过NPY/AgRP、POMC、Kiss 1等神经元对GnRH进行调节之外，还可能通过GnIH这一途径，确切机制仍需进一步研究。

［1］Tsutsui K， Bentley GE， Bedecarrats G， et al. Gonadotropininhibitory hormone （GnIH） and its control of central and peripheral reproductive function［J］. Front Neuroendocrinol， 2010，31（3）： 284-295.

［2］Donato J Jr， Cravo RM， Frazão R， et al. Leptin’s effect on puberty in mice is relayed by the ventral premammillary nucleus and does not require signaling in Kiss1 neurons［J］. J Clin Invest， 2011，121（1）： 355-368.

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EFFECTS OF MICROINJECTION OF LEPTIN INTO LATERAL VENTRICLE ON GNIH EXPRESSION IN RATS’ HYPOTHALAMUS

WEI Meng， WU Jian， SU Wei， et al

（Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective：To explore the effects of microinjection of leptin into lateral ventricle on gonadotropin-inhibitory hormone （GnIH） expression in rats’ hypothalamus. Methods： 10 female Wistar rats were randomly divided into injection of normal saline 6h group and injection of leptin 6h group （n=5）. The rats in 2 groups were respectively injected 4μl normal saline and 4μl leptin into the lateral ventricle after bilateral ovariectomy and injecting 17β-estradiol. Western blot was used to detect the expression of GnIH in rats’ hypothalamus. Results： Compared with rats in injection of normal saline 6h group，the expression of GnIH in hypothalamus of rats in injection of leptin 6h group reduced obviously （P＜0.05）. Conclusions：Leptin may play a role in regulating the hypothalamic-pituitary-gonadal axis by inhibiting the expression of GnIH.

Lateral ventricle； Leptin； Gonadotropin-inhibitory hormone （GnIH）； Hypothalamic-pituitary-gonadal axis

R338.2

A

1004-6879（2015）02-0091-03

2014-09-30）

* 河北省自然科学基金项目（H2013406115），河北省卫生厅医学科学研究项目（20130012），河北省人口计生委科学研究项目（2012-A22），河北省高校重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设项目资助