MTHFD1基因多态性与汉族偏头痛的关联性研究*

何青松安星凯 方杰 林青② 罗娥娜 曲红丽② 马琪林②

MTHFD1基因多态性与汉族偏头痛的关联性研究*

何青松①安星凯①方杰①林青①②罗娥娜③曲红丽①②马琪林①②

目的：探讨MTHFD1基因常见单核苷酸多态性与闽南地区汉族偏头痛的相关性。方法：选择本院偏头痛患者126例作为病例组，按照有无先兆症状分为先兆偏头痛组（MA组）和无先兆偏头痛组（MO组）；选择同期无偏头痛的116例体检者作为对照组。应用荧光能量共振转移技术进行基因型检测，分析不同基因型与偏头痛的相关性。结果：MTHFD1基因R134K和R653Q多态位点在两组人群中的基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。病例组与对照组R134K位点CC、CT、TT基因型频率及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；病例组与对照组R653Q位点GG、GA、AA基因型频率及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；MA、MO组基因型频率及等位基因频率分布与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：MTHFD1基因多态性位点R134K和R653Q可能与闽南地区汉族偏头痛患者无明显相关性。

偏头痛； MTHFD1基因； 多态性； R134K； R653Q

偏头痛是一种慢性、反复发作性的原发性头痛，其实质是一种神经生物功能失调性脑病，具有广泛的临床和遗传异质性，临床主要表现为中重度头痛发作，同时伴有恶心、呕吐、畏光、畏声及视觉症状等。根据先兆症状的有无，该病主要分为有先兆的偏头痛（migraine with aura，MA）和无先兆的偏头痛（migraine without aura，MO）。世界卫生组织2010年全球疾病负担调查显示偏头痛在全球最重的几项疾病负担中名列第7位，被视为20种最能致残的疾病之一［1］。我国的流行病学调查显示偏头痛涉及人群广泛，发病率与国外平均水平无明显差别，达到9.3%［2］。偏头痛频繁发作可导致患者劳动力丧失，学习及日常活动受限，生活质量下降，给社会和家庭造成沉重负担。偏头痛的确切病因目前还不十分清楚，可能是由多种遗传和环境因素共同作用所致。流行病学调查显示遗传因素在偏头痛发病中起着重要作用，呈多基因遗传模式，且MA的遗传倾向强于MO［3］。目前应用全基因组扫描分析，在欧美人群中发现约10个可能与偏头痛有关的基因［4-5］。对中国偏头痛人群的研究同样证实基因变异与偏头痛的发病有相关性［6］。这些研究有助于更好的理解偏头痛的发病机制。

笔者前期的研究曾经发现亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T多态性可能与闽南地区偏头痛患者存在相关性［7］。MTHFR主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。而亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）同样在叶酸代谢通路中有重要作用。目前澳大利亚一项研究提示MTHFD1基因R134K和R653Q位点可能与偏头痛无明显相关性，但西班牙一项研究发现MTHFD1基因R653Q位点增加了偏头痛发病风险，但目前我国尚无此类研究［8-9］。因此笔者在闽南汉族偏头痛人群中开展了偏头痛与MTHFD1基因多态性的关联性研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究采用病例-对照研究方式，纳入偏头痛组及正常对照组。病例组来自就诊于本院神经内科头痛诊疗中心的偏头痛患者，诊断标准采用国际头痛分类第3版（ICHD-Ⅲ）偏头痛诊断标准［10］。每位患者均行颅脑CT/MRI等检查排除颅内占位、鼻窦炎等继发性头痛。对照组来源于同期体检中心就诊人员，每位人员均经神经内科医师采用调查问卷排除头痛等疾病。两组均排除合并肿瘤、免疫性疾病等的患者。两组均签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准，同时研究遵守相关医学法规。偏头痛组包括126例患者，其中男21例，女105例，平均年龄（36.29±11.35）岁，其中先兆偏头痛患者22例（MA组），无先兆偏头痛患者104例（MO组）。对照组包括116名年龄、性别、种族相匹配的健康无头痛人员，其中男19例，女97例，平均年龄（35.56±11.28）岁。两组性别、年龄方面比较差异均无统计学意义（P=0.952、0.619），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取受试者外周血5 mL，经二乙胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝，离心机分离白细胞，用DNA提取试剂盒（上海生工）提取基因组DNA，操作过程参考说明书进行，提取的全基因DNA放置于-80 ℃低温冰箱保存备用。

1.2.2 基因分型 本研究采用荧光能量共振转移（FRET）技术在罗氏实时定量PCR反应系统中进行基因型检测，引物和探针由上海生工公司合成，见表1。PCR反应在10 μL体系中进行，包括DNA聚合酶0.05 U/μL、MgCl23 mmol/L，0.5 μmol/L上下游引物，1 μmol/L的anchor探针和sensor探针，以及DNA模板50～70 ng，以双蒸水调节总体积。PCR反应的条件：94 ℃预变性2 min，然后94 ℃ 10 s→58 ℃ 20 s→72 ℃ 10 s，共进行40个循环。单核苷酸多态性等位基因的荧光信号因为不同的解离温度产生不同的荧光信号，可以应用荧光计通道来分析。

表1 MTHFD1基因多态性位点引物及探针序列

1.3 统计学处理 本研究采用SPSS 22.0软件包建立数据库并进行统计学分析，基因频率和基因型频率采用计数法计算；所有基因型的Hardy-Weinberg平衡检验均采用 χ2检验。计量资料用（±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用率（%）表示，比较采用 χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因分型结果 两组均得到了理想的DNA且经FRET技术均取得了良好的分型结果，见图1。R134K分型结果：纯合子TT的Tm值为62.0 ℃，纯合子CC的Tm值为67.5 ℃，杂合子CT的Tm值为62.0 ℃和67.5 ℃（图1A）。R653Q分型结果：纯合子GG的Tm值为65.0 ℃，纯合子AA的Tm值为68.0 ℃，杂合子GA的Tm值为65.0 ℃和68.0 ℃（图1B）。

图1 MTHFD1基因多态性位点FRET基因分型图

2.2 基因型与偏头痛的关联性分析 MTHFD1基因多态性位点R134K在对照组和病例组中的基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.797、0.241），同样R653Q的基因分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.281、0.963）。病例组与对照组R134K位点CC、CT、TT基因型频率及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；病例组与对照组R653Q位点GG、GA、AA基因型频率及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；MA、MO组基因型频率及等位基因频率分布与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组MTHFD1基因多态性位点基因型及序列频率分布

3 讨论

本研究通过大样本病例对照研究，未发现MTHFD1基因多态性位点R134K和R653Q与闽南地区汉族偏头痛患者存在关联性。进一步的亚组分析同样未能显示两者间有明显关联性。这与澳大利亚Sutherland等［8］开展的研究结果相同。西班牙Oterino等［9］的研究同样未能在病例对照研究中发现两者的关联性，仅仅在联合MTHFR基因C677T变异时显示出协同效应，因此笔者推测MTHFD1基因多态性可能与偏头痛无直接关联性。

高同型半胱氨酸血症已经在临床流行病学调查中被证实与偏头痛的发病有关系［11］。MTHFR是同型半胱氨酸代谢的关键酶之一，其基因变异可导致高同型半胱氨酸血症。笔者前期的一项大样本病例对照研究已经证实MTHFR基因C677T与闽南地区偏头痛有关联性［7］。叶酸参与氨基酸代谢，在甘氨酸与丝氨酸、组氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸与蛋氨酸之间的相互转化过程中充当一碳单位的载体，因此笔者推测叶酸的关键代谢酶亚甲基四氢叶酸脱氢酶1（MTHFD1）在偏头痛的发病中可能起重要作用。MTHFD1基因变异已经被证实与非综合征性唇腭裂、大肠癌、白血病等疾病存在相关性［12-14］。其基因变异导致10-甲基四氢叶酸合成酶的活性区域出现功能下降，会影响叶酸同型半胱氨酸代谢，导致核酸合成障碍和DNA的甲基化异常，最终引发产生染色体畸变［15］。本研究未能在偏头痛人群中发现这种关联性，说明MTHFD1基因变异导致的DNA功能障碍可能未影响到偏头痛相关基因通路。

荧光能量共振转移技术主要应用于膜功能、信号转导、细胞凋亡、基因检测等领域［16］。本研究采用FRET技术检测基因多态性，具有高通量、高精度、高准确性等特点，为开展类似研究提供了良好借鉴。笔者此前利用FRET技术检测儿童急性白血病的基因多态性即取得了良好效果［17］。说明这项技术应用于基因多态性检测具有实用性。

本研究在大样本研究中未能证实MTHFD1基因与闽南地区偏头痛存在明显的关联性，这是首次在闽南地区开展类似研究。但研究存在一定的局限性，如未能对MTHFD1基因其他变异进行分析，样本量偏小等。因此仍需要在更大人群规模、更广深度上进行进一步研究。

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Study on the Association of Polymorphisms in MTHFD1 Gene and the Han Nationality with Migraine

HE Qing-song，AN Xing-kai，FANG J ie，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（36）：012-015

Objective：To study the relationship between polymorphisms in MTHFD1 gene and the han nationality with migraine in south Fujian.Method：126 patients with migraine in our hospital were selected as the patients group，they were divided into the migraine with aura group（MA group） and the migraine without aura group（MO group）.116 physical examinees without migraine were selected as the control group at the same time.Fluorescence resonance energy transfer technology was used to examine the genotype.The relationship of different genotypes and migraine was analyzed. Result：The gene frequency of the R134K and R653Q in MTHFD1 in population of the two groups followed the Hardy-Weinberg equilibrium.There were no statistically significant differences in genotypic and allelic distributions of R134K and R653Q between the patients group and the control group（P＜0.05）.There were also no statistically significant differences in genotypic and allelic distributions of R134K and R653Q between the MA group，MO group and the control group（P＜0.05）.Conclusion：There may be no association between polymorphic site R134K，R653Q in MTHFD1 gene and migraine patients in south Fujian.

Migraine； MTHFD1 gene； Polymorphisms； R134K； R653Q

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.004

2015-09-10） （本文编辑：王利）

国家自然科学基金青年项目（81400912）；厦门市科技局项目（3502Z20154014）

①厦门大学附属第一医院 福建 厦门 361003

②福建医科大学第一临床医学院

③福建省厦门飞朔生物科技有限公司

马琪林

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China