三种新烟碱类农药对蚯蚓体重及溶酶体膜的影响

冯 磊, 张 兰, 张燕宁, 张 佩, 蒋红云

(中国农业科学院植物保护研究所, 农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室, 北京 100193)



三种新烟碱类农药对蚯蚓体重及溶酶体膜的影响

冯 磊, 张 兰, 张燕宁, 张 佩, 蒋红云*

(中国农业科学院植物保护研究所, 农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室, 北京 100193)

新烟碱类农药的大量使用,导致非靶标生物受到威胁,如美国蜜蜂种群数量锐减等。蚯蚓作为土壤生态系统中的一种重要动物,是生态环境安全评价的一个重要指标。本试验采用标准化人工土壤法,研究了吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉3种新烟碱类农药对蚯蚓体重损失率和体腔细胞溶酶体膜稳定性的影响。试验结果表明,仅高浓度吡虫啉(1.6 mg/kg)、噻虫啉(6.4 mg/kg)和氯噻啉(1.6 mg/kg)对蚯蚓生长有抑制作用;3种药剂对体腔细胞溶酶体膜稳定性的影响具有时间和剂量效应,对溶酶体膜的毒性作用随着药剂浓度增加和暴露时间延长而增强。相同剂量下,处理7 d时,氯噻啉引起的蚯蚓体重损失率显著高于吡虫啉和噻虫啉;而对于溶酶体膜的毒性,在处理第2天时,氯噻啉显著高于吡虫啉和噻虫啉。同时,蚯蚓体腔细胞溶酶体膜中性红保留时间较蚯蚓体重损失率更为敏感,更适合于监测低剂量污染物对非靶标生物的影响。

新烟碱类农药; 体重损失率; 溶酶体膜; 中性红保留时间; 蚯蚓

新烟碱类杀虫剂是防治刺吸式害虫如蚜虫、烟粉虱、叶蝉和稻飞虱、蓟马及一些微型鳞翅目和鞘翅目害虫的有效杀虫剂[1]。1991年拜耳公司推出第一个新烟碱类化合物吡虫啉后,由于该类药剂具有杀虫谱广、内吸性强、残效期长和作用机制新颖独特等特点,使其成为一类发展最快的化学杀虫剂[2]。在之后的10年,又涌现出6个新烟碱类杀虫剂：啶虫脒、烯啶虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、噻虫胺、呋虫胺。到2006年,新烟碱类杀虫药剂的销售额达到15.6亿美元,占全球农药市场的17%[3]。但是,有研究报道,新烟碱类杀虫药剂对非靶标生物如蜜蜂等有负面影响[4-5]。因此,新烟碱类杀虫药剂的使用以及对非靶标生物的影响引起了广泛关注。

蚯蚓作为土壤生态系统中一种重要动物,它以土壤有机质为食物,通过掘洞、消化有机质、排泄粪便等直接改变土壤微生物和植物的生存环境[6-8]。同时,蚯蚓通常被视为生态系统中的代表类群而被用于指示、监测土壤污染,是生态环境安全评价的一个重要指标[9]。

有研究表明,农药在使用过程中,仅有1%作用于靶标生物,其余的或残留于土壤,或通过地表径流、淋溶或干湿沉降的方式进入水体,从而对土壤生物和水生生物产生不利影响[10-11]。而以蚯蚓为供试物,对新烟碱类杀虫剂的研究相对较少。本试验以吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉为供试毒物,从体重损失率和体腔细胞溶酶体膜保留时间等方面研究其对蚯蚓的毒性,为进一步的毒性试验研究提供必要的基础资料,同时也为新烟碱类杀虫剂的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试生物

赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)是经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)指定蚯蚓种,从中国农业大学资环学院引种,对污染物具有中等的敏感性,试验时取环带明显且大小较一致的健康成蚓。饲养条件：空气湿度80%～85%;温度(20±1)℃;自然光照。

1.2 供试药剂

96.0%的吡虫啉原药(山东联合山东联合化工股份有限公司)、98.3%的噻虫啉原药(天津兴光农药有限公司)和90.0%的氯噻啉原药(广西田园生化股份有限公司)。试验中所示浓度均为药物的有效成分含量。中性红和乙二胺四乙酸(EDTA)购买自AMRESCO公司;台盼蓝购买自Sigma公司;其他常规试剂均为分析纯,购自北京化工厂。

1.3 试验方法

1.3.1 试验前处理

试验前挑取生殖环带明显、体重在350～500 mg之间的蚯蚓放在湿度35%的人工土壤中(10%泥炭藓、20%高岭土和70%石英砂,碳酸钙调节pH),在空气湿度80%～85%、温度(20±1)℃、pH(6.0±0.5)、自然光照条件下,清肠24 h。

1.3.2 体重损失率测定

采用OECD标准化人工土壤法[12]。在正式试验前进行预试验,根据预试验和推荐施用量确立试验农药浓度范围,吡虫啉和氯噻啉均为0.1、0.4和1.6 mg/kg,噻虫啉为0.4、1.6和6.4 mg/kg。分别称取一定量吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉原药先溶于10 mL丙酮中,与50 g人工土壤混合均匀,待丙酮充分挥发后,再与450 g人工土壤混合均匀,加入蒸馏水,使土壤持水量达到35%,放入1 L标本瓶中,每个浓度3个重复,每个重复10条蚯蚓,用保鲜膜封口,放入培养箱。培养条件为：温度(20±1)℃,湿度80%,光暗比为L∥D=12 h∥12 h。对照只加10 mL丙酮,其他与处理相同。第1天在土壤表面投放5 g牛粪,之后每星期投放等量牛粪。采样：分别在施药后第2、7、14和28天收集蚯蚓,用蒸馏水冲洗干净,再用滤纸吸干水分,称重,并记录。利用公式计算其体重损失率：Ic=(W0-Wt)/W0×100%,式中c是处理农药的含量;Ic是c含量农药处理后的蚯蚓体重损失率,W0和Wt分别是试验开始和试验第t天时蚯蚓的平均体重[13-14]。

1.3.3 溶酶体中性红染色保留时间

1.3.3.1 蚯蚓染毒

方法和浓度同第一步试验。不同的是不添加牛粪,分别在施药后第2、7和14天收集蚯蚓。

1.3.3.2 体腔液提取

参照Eyambe等的方法[15]。药剂处理后的蚯蚓,放在4 ℃生理盐水浸湿的滤纸上清肠24 h后,再放入5 mL离心管中,加入3 mL体腔细胞提取液,刺激3 min后,弃去蚯蚓,剩余液体与17 mL蚯蚓生理林格氏(Ringer)溶液混合,振荡,在4 ℃,150 g下离心5 min,弃去上清液,用1 mL蚯蚓生理林格氏溶液重悬沉淀物,4 ℃下保存备用。体腔细胞提取液：5%乙醇,95%生理盐水,2.5 mg/mL EDTA,pH 7.2。蚯蚓生理林格氏溶液配方：氯化钠4.14 g;氯化钾0.354 9 g;氯化钙4.14 g;硫酸镁0.270 6 g;磷酸二氢钾0.054 4 g;磷酸氢二钠0.042 6 g;碳酸氢钠0.252 7 g。加三蒸水至1 000 mL,然后高压灭菌,4 ℃下保存,pH 7.2。

1.3.3.3 细胞活性测定

体腔细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合均匀,显微镜下观察,分别计数活细胞和死细胞,死细胞被染成明显的蓝色,而活细胞拒染呈无色透明状,统计细胞存活率。

1.3.3.4 中性红保留时间测定

参照Weeks等[16]的方法。首先将20 mg中性红溶于1 mL二甲基亚砜,配制成中性红母液,取10 μL的母液加入到2.5 mL的蚯蚓生理林格氏溶液中,混合得到浓度为80 μg/mL的工作液。然后吸取20 μL的体腔液,加入相同体积的蚯蚓生理林格氏溶液,取20 μL体腔液和林格氏溶液的混合液滴到显微镜的载玻片上。等待30 s使其附着在载玻片上,再加入20 μL的中性红工作液,盖上盖玻片。计时开始,在400倍显微镜下镜检,每隔2 min观察1次,不观察时放于人工气候箱,直到视野中超过50%的体腔细胞被染成粉红色(表明在体腔细胞中,染料已经从溶酶体中渗出),这段时间称为中性红保持时间(NRRT)。

1.4 数据处理及统计分析

用DPS统计软件对试验结果进行统计分析,不同处理间体重损失率和中性红保留时间采用两组样本均值差异t检验方法进行处理组之间的差异比较。

2 结果与讨论

2.1 三种新烟碱类杀虫药剂对蚯蚓体重的影响

如图1所示,不同浓度的吡虫啉处理不同时间后,只有1.6 mg/kg吡虫啉处理在第2天对蚯蚓的生长有抑制作用,蚯蚓体重损失率为12.15%,其他处理组蚯蚓体重均随时间延长而增加,但1.6 mg/kg处理组体重增加显著慢于对照及0.1和0.4 mg/kg处理组。不同浓度的噻虫啉处理不同时间后,0.4和1.6 mg/kg噻虫啉对蚯蚓的生长没有抑制作用,仅6.4 mg/kg噻虫啉在第2、7、14和28天对蚯蚓的生长有抑制作用,说明6.4 mg/kg噻虫啉明显地抑制蚯蚓的生长。氯噻啉与吡虫啉的趋势相同,0.1和0.4 mg/kg氯噻啉在各个时间点对蚯蚓的生长都没有抑制作用。只有1.6 mg/kg处理的蚯蚓在第2和7天对蚯蚓的生长有抑制作用,蚯蚓体重损失率分别为17.24%和12.00%。通过差异显著性分析,在相同剂量(0.4 mg/kg)处理下,3种药剂处理组与对照组均没有显著差异,而在1.6 mg/kg处理第7天时,氯噻啉处理后的蚯蚓体重损失率(12.00%)显著高于吡虫啉和噻虫啉处理后的蚯蚓体重损失率(-1.10%和-15.34%)。

2.2 细胞活力

结果表明,提取的细胞体腔液离心,通过台盼蓝染色,测定的细胞存活率大于90%,符合试验要求,并与Gupta[17]的报道相近。

2.3 三种新烟碱类杀虫药剂对蚯蚓溶酶体中性红染色保留时间的影响

吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉各浓度组对蚯蚓溶酶体的中性红保留时间的影响见图2。随着染毒剂量增加和暴露时间延长,吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉对溶酶体膜的毒性作用增强,且各染毒处理组的中性红保留时间与对照组相比均显著缩短。染毒2 d后,吡虫啉(0.1 mg/kg)、噻虫啉(0.4 mg/kg)和氯噻啉(0.1 mg/kg)对蚯蚓NRRT分别为(102.00±3.46)min、(53.33±5.03)min和(58.00±9.17)min,显著低于对照组(117.33±11.02)min,吡虫啉对蚯蚓溶酶体膜的损伤明显低于噻虫啉和氯噻啉,这可能是噻虫啉和氯噻啉亲水性比吡虫啉高,更容易进入蚯蚓体内,发挥作用。通过差异显著性分析,在处理第2天时,相同浓度(0.4 mg/kg)下,氯噻啉(42.00±4.00)min中性红保留时间显著低于吡虫啉(82.67±7.57)min和噻虫啉(53.33±5.03)min;而且在1.6 mg/kg下,氯噻啉(38.00±2.00)min中性红保留时间也显著低于吡虫啉(62.67±3.06)min和噻虫啉(45.33±3.05)min。可见,相同剂量下,处理第2天时,氯噻啉对溶酶体膜的损伤显著高于吡虫啉和噻虫啉。

图2 不同浓度的吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉处理对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜NRRT的影响Fig.2 Effects of different concentrations of imidacloprid,thiacloprid and imidaclothiz on the NRRT of earthworm coelomocytes

新烟碱类杀虫药剂会影响酶促反应等正常的生理代谢[18],促进活性氧的产生,从而产生过多的自由基,削弱机体的抗氧化防御体系,造成细胞损伤[19]。脂质过氧化是细胞损伤的一种特殊形式,也是许多毒物对机体组织细胞产生作用的起点。脂质过氧化效应中最明显的就是膜脂质的完整结构受损,细胞膜或细胞器膜的通透性改变,如溶酶体膜通透性改变[20]。因此,暴露于吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉的蚯蚓,在低浓度时,在经过2 d的暴露后,NRRT显著缩短,表明NRRT作为一种敏感的生物标志可用来指示低浓度药剂对蚯蚓在亚细胞水平上产生的影响,从而作为土壤污染的预警系统对土壤污染做出快速的诊断。

3 结论

仅高浓度吡虫啉(1.6 mg/kg)、噻虫啉(6.4 mg/kg)和氯噻啉(1.6 mg/kg)对蚯蚓生长有抑制作用。

吡虫啉、噻虫啉和氯噻啉处理后蚯蚓体腔细胞溶酶体膜中性红保留时间随染毒剂量增加和暴露时间延长而缩短。

相同剂量下,氯噻啉引起的蚯蚓体重损失率及对溶酶体膜的毒性要高于吡虫啉和噻虫啉。

蚯蚓体腔细胞溶酶体膜中性红保留时间较蚯蚓体重损失率更为敏感,更适合于监测低剂量污染物对蚯蚓的影响。

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(责任编辑：田 喆)

Effects of three neonicotinoids on the weight and neutral red retention time of earthworm (Eiseniafetida)

Feng Lei, Zhang Lan, Zhang Yanning, Zhang Pei, Jiang Hongyun

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Neonicotinoids are widely used to control a broad spectrum of sucking and some chewing pests, but they also have negative impacts on non-target organisms that attract more and more attention. Earthworms are considered as important bioindicators of chemical pollution in the soil ecosystem. In this study, the weight loss and neutral red retention time (NRRT) in the earthwormEiseniafetidatreated with imidacloprid, thiacloprid and imidaclothiz were investigated. Our results showed that high concentrations of imidacloprid (1.6 mg/kg), thiacloprid (6.4 mg/kg) and imidaclothiz (1.6 mg/kg) inhibited the growth of earthworms. Their toxicity to lysosomal membranes increased with exposure concentration and time. The effect of imidaclothiz on the weight (7 d) and lysosomal membranes (2 d) of earthworms was significantly higher than that of imidacloprid and thiacloprid at the same concentrations. However, the neutral red retention time was more sensitive than the weight loss and more suitable for monitoring the impact of low-dose pollutants on the growth of non-target organisms.

neonicotinoid; weight loss; lysosomal membrane; neutral red retention time; earthworm

2014-05-04

2014-06-19

国家自然科学基金(31171878，31272079)

S 482.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.007

* 通信作者 E-mail:hyjiang6281@gmail.com