测序技术发展状况及相关专利分析

毛舒燕，梁婧文

测序技术发展状况及相关专利分析

毛舒燕*，梁婧文*

基因是生物体的遗传信息载体，其遗传和表达影响生物体的繁衍及各种生命活动。对于人类而言，个体基因组DNA 序列突变往往会导致疾病的发生，获取个体的基因组DNA 信息将有助于疾病的预防、诊断和治疗［1］。正因如此，科学家们奉献了无数心血研究 DNA 或RNA 测序技术，以期解密这些神奇的生命密码。于此同时，基因测序所带来的巨大经济利益也使得更多科研机构和企业积极投身于这项改变世界的事业，企业乃至国家之间的竞争愈演愈烈。

1 专利申请概况

1.1 DNA 测序技术全球专利申请趋势

自 20世纪 80 年代，开始有 DNA 测序技术的相关专利申请提出。以 WPI 数据库中专利申请的最早优先权日和最早公开日统计，自 1984 年起，全球 DNA 测序技术相关专利申请共计 1257 项；通过分类号和人工浏览去噪，针对测序方法、设备和试剂的专利申请共计 344 项（图 1数据截至 2014 年 9 月 14 日）［2］；这期间出现了两个高潮阶段，主要集中在 1998 - 2004 年和 2006 - 2013 年，正好对应了第二代和第三代测序技术的兴起。

第一代测序技术出现于 20世纪 70 年代，专利申请相对较少，直至 1995 年第一台测序仪上市以及人类基因组测序计划的启动和进行，人们逐渐意识到现有测序技术的不足之处，也认识到测序技术在疾病诊断领域的巨大价值，专利的申请量逐渐增多。至 2000 年前后，第二代 DNA 测序技术兴起，短时间内的专利申请量急剧升高，指征着有关DNA 测序的核心技术或理念的出现，以及人们对于 DNA测序技术发展的集中关注。第三代 DNA 测序技术兴起于2006 年后，相关专利产出量基本延续了 1998 - 2004 年之间的快速增长趋势，维持着较高的专利产出水平，反映出DNA 测序技术的研究热度仍在延续。

图1 近 30 年来全球测序技术相关专利年度申请量趋势

图2 DNA 测序技术全球重要专利技术产出地

1.2 DNA 测序技术专利产出分布

专利申请的优先权国别/地区和最早申请国别/地区通常是该项专利技术的研发地，通常可认为是该项技术的产出地，体现了各国家或地区的科研实力以及专利保护意识的强弱［2］。图 2 展示了 DNA 测序技术的专利产出地分布情况，数据显示，美国、日本、欧洲专利局（是指首次申请是通过欧洲专利局递交，这部分专利申请主要来自欧盟国家）、英国和韩国的专利申请量分列全球前 5 位，其中美国的申请量远超过其他国家，占全球前十位国家总申请量的 57.8%，这说明 DNA 测序技术领域呈现出美国一家独大的态势。因此，做 DNA 测序技术相关的研发，对美国专利进行分析和研究都是非常必要的。而我国在该领域专利申请量位列全球第 6，表明我国具有一定的科研能力，专利保护意识也在逐渐加强。

2 技术发展历程

测序技术最早可以追溯到 20世纪 50 年代，早在1954 年就已经出现了关于早期测序技术的报道，图 3 展示了测序技术的基本发展历程。

2.1 第一代测序技术——链终止法和化学降解法

2.1.1 链终止法 1975 年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创了链终止法（dideoxy chain-termination method）。其核心原理是：由于 ddNTP 的 2' 和 3' 位都不含羟基，其在 DNA 的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断 DNA 合成反应，在 4 个 DNA 合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的 DNA 序列［3］。

2.1.2 化学链降解法 1976 - 1977 年马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发表了化学测序法（链降解），此项方法基于对核碱基特异性地进行局部化学改性，接下来在改性核苷酸毗邻的位点处 DNA 骨架发生断裂，由于经纯化的 DNA 可被直接使用，马克西姆-吉尔伯特测序法迅速得到了推广。但由于其技术复杂、大量使用危险药品及难于扩大规模的缺陷，逐渐被市场淘汰。

2.1.3 鸟枪法 1980 年，桑格又发明了“鸟枪法测序”，将大分子 DNA 片段随机打断成小片段，分别测序后，再利用小片段之间的重叠段进行拼接，从而读出原来的长片段的序列［4］。该技术为第二代测序技术的发展奠定了技术基础。

第一代测序技术最大的贡献在于，在 2001 年完成了首个人类基因组图谱。但因其成本高、速度慢、通量低，且需要大量专业技术人员全程操作等不足，随着时代的进步，越来越无法满足科学研究和生产应用的需要。

2.2 第二代测序技术——边合成边测序

2.2.1 GS FLX 系统 GS FLX 系统的关键技术在于单链DNA 结合在水油包被的直径约 28 μm 的磁珠上进行独立的 PCR 反应。其测序原理是基于焦磷酸测序法，通过检测每一个聚合 dNTP 携带的荧光信号对 DNA 序列进行实时检测。该技术核心专利申请 WO02077287 于 1999 年提出（最早优先权日），请求保护用于 DNA 测序的装置和方法，对其核心技术进行了全面的展示和披露。

2.2.2 Solexa 和 Hiseq系统 Solexa 和 Hiseq 系统的关键技术在于利用单分子阵列实现在小型芯片（flow cell）上进行桥式 PCR 反应。在生成新 DNA 互补链时，由于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息［4］。该技术在专利申请 WO9844151 中公开，专利申请 WO0063437中主要对检测荧光信号的方法进行了保护。

2.2.3 SOLiD 系统 SOLiD 系统则以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的 SOLiD 颜色编码序列，使得每一个碱基都被检测两次，提高了系统准确性［4］。其核心专利申请 US4811218、WO9001562 和WO200713706 分别在 1989 年和 2006 年提出，请求保护了用于 DNA 测序的设备和方法。

第二代测序技术是迄今为止发展最为成熟、使用最为广泛的 DNA 高通量测序手段，在基因组大规模测序和基因诊断治疗中功不可没，但是其不足也日益凸显，如读长较短，PCR 扩增偏差等。在这种情况下，以单分子测序技术为基础的第三代测序技术应运而生。

2.3 第三代测序技术——单分子测序

图3 DNA 测序技术发展历程

2.3.1 并行单分子合成测序技术 该技术以 HelicosBiosciences 公司的 tSMSTM（true single molecular sequencing）技术平台为代表，测序原理为：通过 DNA 剪切以及添加多聚 A 尾产生 DNA 片段，然后与固定在流动单元的poly-T 寡核苷酸进行杂交，对每个新添加的 dNTP 的荧光标记进行测序［5］。

2000 年至今，该公司申请基因测序相关专利申请多达51 项，涵盖测序试剂、测序方法、测序设备、检测方法等多个领域；相比于其他公司，该公司更侧重于对测序试剂的改进研发，相关专利申请达 13 项之多。虽然其专利申请进入多个国家和地区，但并没有在中国进行布局。

2.3.2 SMRT 技术 SMRT 技术是基于边合成边测序的思想，进行单分子实时测序，具体利用“零模式波导（zeromode wave-guides，ZMWs）”小孔测序芯片完成，该小孔直径只有几十个纳米，激光无法直接穿过小孔，而会在小孔处发生衍射，通过检测分散到各个 ZMW 小孔的 DNA片段的荧光标记来判定 dNTP 的种类［5］。

Pacific Biosciences 公司 SMRT 技术的核心专利申请为 WO2006083751，首次披露了测序所使用的芯片结构和荧光信号检测方法；专利申请 WO2007019582、US2007206187、WO2007041342 分别对光学信号的监测方法和系统、设备、反应所使用的试剂进行了改进。2006 年后还有很多围绕核心技术进行改进的专利申请，分别涉及DNA 聚合酶的锚定连接、荧光信号检测方法、荧光染料、反应试剂等方面；2008 年专利申请量达到最高峰，全球范围内共 116 件。

2.3.3 纳米孔单分子技术 Oxford Nanopore Technologies公司研发的测序技术为水解测序法，其核心是基于纳米孔单分子实时读取技术，检测单碱基短暂的影响流过纳米孔的电流变化，从而检测出 DNA 序列信息［5］。

Oxford Nanopore Technologies 公司自 2006 - 2007 年开始研发纳米孔单分子测序技术，并在研究初期就提出专利申请，分别涉及脂质双分子层结构（WO2009077734）、能够穿透脂质双分子层进行电学信号传导的传感器（WO2008102120）、核酸外切酶和孔的构建体（WO2010004265）、核酸外切酶的改造（GB0901751D0）等；直至 2010 年才公开了其核心专利申请 WO2010004273，具体保护了用于 DNA 测序的 Nanopore；并在此之后，逐步对其核心技术进行改进完善，包括脂质双分子层结构的改进、Nanopore 测序平台、计算方法的改进等。

2.3.4 基于 FRET的测序技术 基于荧光共振能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的测序仪最初由 VisiGen Biotechnologies 公司开发，基本原理是先将被供体荧光基团修饰的 DNA 聚合酶和 DNA 模板分子固定在固体表面，在被不同颜色的受体荧光基团标记的核苷酸掺入时，会释放一个 FRET 信号，使 DNA 分子发光，而发光的颜色则提示了碱基的类别［5］。涉及该技术的专利申请共 7 件，公开号为：WO2004059011、US7906280、US2007202521、KR20110132131、US2012219961、WO2011090745、WO0125480，申请人来自多个公司，其中仅有一件医疗生物系统有限公司的专利申请 CN1391615进入中国。

2.3.5 半导体测序技术 2010 年底 Ion Torrent 公司推出了一种基于半导体芯片的新一代革命性测序平台—— Ion Torrent PGM。该测序平台的技术核心为离子流半导体技术，即使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池，当 DNA 聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的 DNA 链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的 pH 发生改变，从而读出 DNA 序列［6］。其测序过程是通过检测H+信号的变化来获得序列的碱基信息。该技术核心专利申请 5 件，公开号为 WO2010016937、WO2010138188、WO2010138187、WO2010047804、WO2010008480，涵盖递送试剂的流控系统、多步骤电化学反应的装置、中心测序装置、分析装置、减噪方法等各个技术领域，并有 4 件核心专利申请进入中国。

通过上述第三代测序技术介绍可以看出，第三代测序技术因为不需要依赖 PCR 扩增，克服了 PCR 对测序的影响，很好地解决了第二代测序技术难以克服的重复片段的测序问题，技术优势明显，拥有更广阔的应用前景。

2.4 第三代测序技术比较

图4 第三代测序技术主要申请人分析

对上述第三代测序技术持有者的专利申请情况和其进入中国的专利申请数量（项）进行总结和比较发现（以上专利申请的检索均在 Sipoabs 数据库中完成，以申请人为检索入口），大部分技术的核心专利申请都进入中国，但进入中国的专利申请占其专利申请总量比例较小（图 4）。Pacific Biosciences 公司无疑成为了第三代测序技术中的龙头老大，而专利申请数量不多的 Ion Torrent 也获得了较高的市场占有量，这同各个测序技术的优缺点、适用范围、测序成本都有着密不可分的关系，表 1 详细比较了第三代测序技术的性能和优缺点。

表1 第三代测序技术性能比较

表2 三代测序技术适用范围比较

表3 主流测序平台的测序成本比较

2.5 三代测序技术总结

表 2 选取代表性测序方法和平台对比了三代测序技术的优缺点和适用范围（第三代测序方法以 Ion Torrent 为例），该表反映出测序技术的发展脉络和方向，也体现了测序技术应用的新需求，由大规模基因组测序到小规模染色体、转录组、直至具体基因的测序。而若要将测序技术推广应用于疾病诊断，由患者买单，那么如何降低测序成本就成为了开发者必须攻克的难关。通过总结目前市场主流测序平台的测序成本（表 3），也不难看出为何 Ion Torrent 能从第三代测序技术中脱颖而出，其测序成本的低廉无法不受到市场的青睐。

3 主要申请人分析

由图 2 可看出，测序技术领域主要被国外申请人所占据，国内申请人涉足此行业时间较短，多为购买国外仪器设备进行下游应用和开发。因此，选取在测序技术领域占据龙头地位的 Illumina、一直期望兼并 Illumina 并与之抗衡的Roche 和第三代测序仪的成功代表 Ion Torrent 作为重点申请人，对其技术开发历程、专利申请情况、市场份额进行如下分析。

3.1 Illumina

Illumina 公司成立于 1998 年，最初是以基因分型和微列阵为主要技术和研发方向。经过 16 年的发展，该公司2014 年被评为“全球创新企业 50 强”。到目前为止，其拥有了基因组测序仪市场 70% 的份额，是名副其实的测序仪大鳄。作为创新企业榜首的 Illumina 公司非常重视其在全球范围内的专利布局，不仅通过自主研发获得专利技术，频繁的收购活动也使其积累了大量的专利技术财富。其中最重要的一次收购即为 2007 年斥资 6 亿美元购买了拥有先进基因测序技术的 Solexa 公司，收获了其全部测序技术专利，并因此推出了其第一代的 Genome Analyzer 测序系统。随后，又陆续收购了生产基因测序试剂的 Epicentre 公司（2011 年）、专注于染色体筛选诊断的 Bluegnome 公司（2012 年）、专注于繁殖和遗传健康的 Verinata 公司（2013年）、专注微流样品处理的 Advanced Liquid Logic 公司（2013 年）、专注于基因组信息学的 NextBio 公司（2013年）［7］。

截至 2014 年 3 月，在 Sipoabs 数据库中，申请人Illumina 公司，包括其收购的其他公司，全球共申请 11259 件专利，专利数量呈逐年稳定增长态势，并在美国、欧洲、中国均有专利布局。就专利技术领域分布而言，其专利涉及液滴操作、射流装置、测试样品储存器件、测序系统、测试成像方法、样品加热器件、数据分析方法、核苷酸合成等与测序平台相关的全方位的技术领域，完美体现了其技术的全面性及相应的知识产权保护的全面性。2010 年以后，Illumina相继推出了升级后的 HiSeq 2000、HiSeq 2500 以及新一代小型 Miseq 高性能测序仪，进一步降低了测序成本，使得1000 美元测出全基因组序列成为可能。其中 Miseq 高性能测序仪更是因其卓越的性能和小型化的优势，使其应用领域更加宽广，受到更多非实验室用户的追捧。具有这些技术上的优势，就不难解释，Illumina 为何能够坐拥基因组测序仪市场 70% 的份额，并让其最大的竞争对手罗氏（Roche）不惜重金想要将其收入麾下［8］。

3.2 Roche

相比 Illumina，Roche 在测序技术领域的开拓则没有那么顺利。2007 年 3 月，罗氏诊断（Roche Diagnostics）与CuraGen 公司签订协议，以 1.55 亿美元的现金和股票收购454 Life Science——超高通量基因组测序系统 Genome Sequencer 20 System 的拥有者。由于 GS FLX 测序系统具备高通量、高灵敏度、读长较长、准确性高等优点，其甫一问世就获得广泛关注；但由于其高昂的使用费用，推广应用受到局限。自 2008 - 2009 年，以 Heliscope、Nanopore、Ion Torrent 等为代表的第三代测序技术兴起，其读长可达1000 bp，准确率为 96% ～ 98%，测序通量较 GS FLX 小，但其每循环的耗时大大缩短，测序费用也更为低廉，这对GS FLX 测序市场造成了较大冲击。罗氏虽没有透露 454业务的收入情况，但随着第三代测序技术销量的上升，454测序仪已经被推到了市场边缘。2013 年起，罗氏公司开始关闭 454 生命科学测序业务，并表示“454 测序仪将在2016 年被逐步淘汰”。

自 2010 年起，罗氏开始追赶新一轮的测序技术浪潮，与 IBM 和 DNA Electronics 结成联盟，并在 2012 年初敌意收购 Illumina，不过 Illumina 拒绝了该收购要约；同年底，罗氏再次同 Illumina 进行协商，但交易仍未达成。罗氏与 IBM 和 DNA Electronics 的合作也并不长久，2013年即宣布结束，并停止了在半导体测序和纳米孔测序技术上的研发努力。

种种挫折并没有打消罗氏对测序新技术的追求渴望，并更加坚定地确信测序技术将在未来的生命科学和诊断领域扮演至关重要的角色。2013 年 9 月，罗氏与 Pacific Biosciences 达成协议，投资高达 7500 万美元与 Pacific Biosciences 合作开发以 PacBio SMRT 技术为基础的诊断产品。2014 年 6 月 2 日，罗氏宣布将以 1.25 亿美元的现金和高达 2.25 亿美元的里程碑费用收购美国纳米孔测序公司的 Genia Technologies。

截至 2014 年 9 月，在 Sipoabs 数据库中，以申请人ROCHE +、关键词 sequenc + 为入口、以申请人 454 life tech+、Genia 为入口进行检索发现，罗氏所拥有的 DNA 测序相关专利申请共有 103 项，核心专利全部进入中国。而其拥有的第三代 Genia 测序技术实质为单分子纳米孔测序方法，有望降低测序成本，并提高测序的速度、准确性和灵敏度。

3.3 Ion Torrent

2010 年 10 月，美国《福布斯》杂志以封面文章报道了 Ion Torrent 公司企业家乔纳森·罗森伯格（Jonathan Rothberg）和他发明的基因解码器（decoder）。这种基于硅芯片的个人染色体检测仪（personal genome machine，PGM）是当今世上体积最小、检测成本最低的上市产品，可在 2 h之内，高精度解读 1000 万 nt，这款仪器的售价仅为 5 万美元，是目前常用测序仪售价的 1/10。2011 年 5 月德国肠出血性大肠杆菌疫情爆发，华大基因组的科学家仅用三天的时间就完成了对这种新型细菌的基因组测序和分析，该项目的负责人称，快速测序很大程度上得益于第三代测序仪Ion Torrent［4］。作为一家创业公司，Ion Torrent 非常重视其核心技术的知识产权保护，在 Sipoabs 数据库中，以申请人为入口进行检索，在从 2007 年到 2010 年 3 年间共申请了 11 项 45 件专利，其中有发明专利 7 项，多项专利申请分别进入了美国、英国、中国、日本、印度、新加坡等国。也正是因为看上其宝贵的专利技术资源，生物产业巨擘生命技术公司（Life Technologies）于 2013 年 8 月用价值3.75 亿美元的资金和股票收购了 Ion Torrent。2014 年 2 月3 日 Thermo Fisher 宣布收购了生命技术公司。

4 我国测序技术发展现状

作为生物基因产业链最上游的产业，基因测序技术的发展必将起到龙头作用，不断推动下游基因应用产业的发展，随着基因检测与医疗诊断的结合，其市场价值更是空前的高涨，成为各个国家及大型企业积极投资和发展的重要领域。

4.1 国内测序技术发展现状

从上文的分析我们可以看出，新一代的高通量测序技术的研究开发和应用都被少数几家欧美公司所垄断，国内涉足此行业的机构多为购买国外大公司的仪器设备进行测序，具有中国自主知识产权的新一代高通量低成本测序技术系统的研发较为薄弱（以下专利申请的检索均在 Sipoabs 数据库中完成，以申请人为检索入口）。

4.1.1 华大基因 做为国内测序企业的龙头老大，华大基因拥有 137 台 Illumina HiSeq 2000 测序仪、27 台 ABI SOLiDTM4.0 System、罗氏 454 测序平台和最新的 Ion Torrent 测序平台，与美国 Broad 研究所、英国 Sanger 中心一起成为公认的世界最强的三大基因组研究机构［4］。虽然华大基因的主要测序平台都购自国外公司，但其技术优势在于拥有自主开发的数据分析软件。截至 2014 年 8 月，华大基因拥有测序拼接、注释、纠错相关的核心技术专利12 件，涉及文库构建、测序方法、数据分析的专利更是多达上百件，其中 PCT 申请 32件，使其在序列分析领域的力量不容小觑。与此同时，华大基因并没有放弃测序仪领域的知识产权占有和开发，2013 年华大基因斥资收购美国Complete Genomics 公司的全部知识产权，以及 Life Tech公司的 Ion Proton 系统，进而推出了 BGISEQ-1000 和BGISEQ-100 两款仪器，这两款仪器均已通过 CFDA 批准用于临床诊断。

4.1.2 华因康基因科技技术有限公司 同样创立于深圳的华因康基因科技技术有限公司也积极投入新一代高通量基因测序系统研发。该公司研发的高通量测序技术平台SeqExpert-IIIA 测序仪及 PSTAR-II 系列高通量基因测序系统，拥有 7 项美国专利，3 项 PCT 国际专利，16 项中国专利以及 22 项计算机软件著作权［9］。上述专利申请涵盖了测序仪、测序控制系统、测序方法及应用、生物样品制备、生化试剂等多个技术项目，代表了目前国内最先进的测序技术，得以在新一轮的技术及市场竞争中与国际知名的基因产业大鳄相抗衡。

4.1.3 中国科学院基因组所 2013 年中国科学院基因组所和紫鑫药业合作开发的第二代高通量测序系统项目正式签订了投资意向协议，意欲打造“中国芯”的测序系统，虽然该系统尚未面世，但其已经开始专利的布局。2012 - 2014年，共申请测序仪及其相关系统的核心专利 10 件，其中9 件都已经获得中国国家知识产权局专利局的授权。

4.2 测序技术应用企业现状

尽管我国拥有自主知识产权的基因测序公司较少，但是利用测序技术，寻求下游应用技术市场的企业比较多。我国作为全球人口最多的国家，在这一领域也表现出了巨大的市场潜力。单就产前诊断这一应用领域的市场，据估算就在150 亿元左右。2013 年华大基因、贝瑞合康在无创产前筛查领域分别测序 10 万人次和 5 万人次，占据了大部分市场份额。除此之外，安诺优达、锐博生物、达安基因等依托测序技术的企业，共同分享着中国巨大的基因诊断市场。另外，美吉生物、诺禾致源则利用国外的测序系统，依托各自的生物信息分析能力，为更大范围的科研、临床医学［10］、卫生检疫、农业等领域提供测序、生物信息分析等服务［4］。

4.3 挑战和机遇

尽管就现有的测序技术发展现状来看，我国的测序技术研发相对落后、行业规模较小、技术力量薄弱，关键技术均被国外申请人牢牢把握、占领，但是，这并不意味着我国的测序技术没有发展空间。高通量测序技术不仅涉及生物学一个科学领域，还涉及纳米加工技术、微体积溶液控制、高速分子化学反应、高通量成像、计算软件、数据压缩、数据处理等多个领域的最新技术［11-12］。因此，在更快、更准、更廉价的技术发展要求下，我国的科研机构和企业大可以放开手脚、另辟蹊径，从以上多领域入手，多维度改进现有基因测序技术和基因测序平台，并积极申请专利，掌握自主的核心知识产权。在下游应用方面，提高数据处理能力、积极开发数据处理软件及基因诊断产品将成为科研机构和企业的主攻方向，对测序结果的精确解读将会带来更多更广的收益。因此，在测序技术下游，如科研服务、临床诊断、卫生防疫、健康保险、司法鉴定、食品安全、生物能源等多个领域占领市场也不失为一个明智的选择。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.015

100190 北京，国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心医药生物部生物工程一室

毛舒燕，Email：maoshuyan@sipo.gov.cn

2015-02-03

*同为第一作者