UFLC法同时测定参花胶囊中9个成分的含量

肖会敏，康小刚，鲍沈平，杨 倩，谢艳华，王四旺

（第四军医大学：1药学院药物研究所，2西京医院神经内科，陕西西安710032；3沈阳军区司令部门诊部，辽宁沈阳110000）

UFLC法同时测定参花胶囊中9个成分的含量

肖会敏1，康小刚2，鲍沈平3，杨 倩1，谢艳华1，王四旺1

（第四军医大学：1药学院药物研究所，2西京医院神经内科，陕西西安710032；3沈阳军区司令部门诊部，辽宁沈阳110000）

目的：建立UFLC法同时测定参花胶囊中绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量，为制剂质量控制提供理论依据．方法：色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0．5%磷酸水溶液（每1000 mL含2．0 g磷酸二氢钾）梯度洗脱；流速：1．0 mL／min；检测波长：230 nm（芍药苷、甘草酸），270 nm（甘草苷、隐丹参酮、丹参酮ⅡA），330 nm（绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B）；柱温：30℃；进样量：5 μL．结果：在上述色谱条件下，9个成分的峰具有良好的分离度；绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的线性范围分别为 7．00～70．00、40．00～400．00、62．50～625．00、13．00～130．00、8．80～88．00、50．00～500．00、48．00～480．00、5．00～50．00和8．20～820．00 mg／L，相关系数分别为0．9999、0．9994、0．9998、0．9996、0．9994、0．9995、0．9995、0．9994和0．9994；9个对照品的平均加样回收率均在98．6%～99．20%之间，RSD均在0．5%～2．0%之间；10批制剂中绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的平均含量（mg／粒）与RSD（%）值分别为0．243、0．80，2．139、0．65，1．321、0．57，0．316、1．55，0．414、1．79，8．815、0．10，1．033、0．16，0．173、1．19，0．487、0．79．结论：9个成分的含量测定方法简便、稳定可靠、准确，可作为参花胶囊质量评价方法之一．

参花胶囊；高效液相色谱；甘草苷；迷迭香酸；绿原酸；羟基红花色素A；芍药苷；丹参酮ⅡA

0 引言

参花胶囊由丹参、川芎、红花、赤芍、菊花、山楂、甘草七味中药组成．本组方主要用于活血化瘀、行气止痛等．方中丹参主要活性成分有丹参酮类、丹酚酸类［1］．川芎所含有效成分为四甲基吡嗪、阿魏酸、挥发油等［2］．红花主要有黄酮类如红花黄色素、羟基红花黄色素A等［3］．赤芍的化学成分主要为单萜及单萜苷类化合物如芍药苷、羟基芍药苷等［4］．菊花主要成分为挥发油成分、黄酮类化合物和绿原酸等［5］．山楂的成分有黄酮类、有机酸类等［6］．甘草中活性物质有甘草苷、甘草酸等［7］．本处方由水提与醇沉等工艺制成．为分析该方中的功效成分，本研究采用快速液相色谱（UFLC）法对其进行分析，对该制剂中9个成分即绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA进行定量分析．

1 仪器和试药

岛津高效液相色谱仪，型号Prominence UFLC，配LC-20AD双泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20ACHT自动进样器，CTO-20A柱温箱，LC／Labsolui-on色谱工作站，日本岛津公司；电子分析天平，型号RD-200，德国塞多利斯公司；KQ-300DE数控超声波发生器，昆山超声仪器有限公司．乙腈、甲醇，色谱级，美国Honeywell公司；水为自制超纯水，由美国Millipore纯水仪，美国millipore公司；其余为分析纯．绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品均购自中国药品生物制品检定研究院；参花胶囊（批号 20090908，2009091，20090928，20130601，20130602，20130603，20130604，20130605，20130606，20130607）由第四军医大学药学院药物研究所研制．

2 方法和结果

2．1 色谱条件［8］色谱柱为Kromasil C18（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0．5%磷酸水溶液溶液（B，每1000 mL溶液中含2．0 g磷酸二氢钾），梯度洗脱，0～15 min，A 5%→21%；15～45 min，A 21%→42%；45～75 min，A 42%→100%；75～80 min，A 100%．记录时间为80 min．体积流量：0．8 mL／min；柱温：30℃；检测波长：分别为230 nm（芍药苷、甘草酸）、270 nm（甘草苷、隐丹参酮、丹参酮ⅡA）、330 nm（绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B）；进样量：5 μL．

2．2 混合对照品溶液与供试品溶液的制备

2．2．1 混合对照品溶液的配制 精密称取绿原酸7．00 mg、迷迭香酸8．80 mg、丹参酮ⅡA 8．20 mg置于10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，即得3个对照品混合溶液（A溶液）．另精密称取羟基红花色素A 4．00 mg、芍药苷6．25 mg、甘草酸4．80 mg、甘草苷13．00 mg、隐丹参酮5．00 mg、丹酚酸B 5．00 mg置于10 mL量瓶中，精密加入A溶液1．00 mL，再加70%甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（含9个对照品），作为储备液（B溶液）．

2．2．2 供试品溶液的制备 取10粒本品内容物，称取0．5 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇适量，超声30 min，放凉，加70%甲醇至刻度，滤过（0．45 μm滤膜），滤液作为供试品溶液．

2．3 线性关系的考察 分别精密量取B溶液0．10、0．20、0．40、0．80，1．00 mL对照品溶液于1 mL量瓶中并加70%甲醇稀释至刻度即得，用0．45 μm微孔滤膜滤过，进样．分别以各对照品的浓度（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标绘制标准曲线，计算，得线性方程，结果见表1，表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好．

表1 各对照品的线性方程及其浓度范围

2．4 精密度试验 精密吸取上述线性对照品溶液（0．20 mL B溶液加70%甲醇定容至1 mL），重复进样5次，结果测得相对标准差（RSD）：绿原酸为0．81%，羟基红花色素 A为 0．87%，芍药苷为0．95%，丹酚酸B为0．95%，甘草酸为0．78%，甘草苷为0．83%，迷迭香酸为 0．92%，隐丹参酮为0．62%，丹参酮ⅡA为0．98%，表明仪器精密度良好．

2．5 重复性试验 精密称取样品（批号20090908）5份，分别按“2．2．2”项下方法制备供试品，按“2．1”项下条件测定．测得平均含量与RSD值结果：绿原酸为0．24 mg／g与1．13%，羟基红花色素A为2．12mg／g与1．07%，芍药苷为1．31 mg／g与1．02%，丹酚酸B为8．80 mg／g与1．25%，甘草酸为1．03 mg／g与1．11%，甘草苷为0．31 mg／g与1．31%，迷迭香酸为0．40 mg／g与1．03%，隐丹参酮为0．17 mg／g与0．94%，丹参酮ⅡA为0．48 mg／g与1．42%．表明该方法重复性良好．

2．6 稳定性试验 精密吸取上述线性对照品溶液（0．20 mL B溶液加70%甲醇定容至1 mL），在第0、2、4、8、16、24 h进样．结果，绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的峰面积的RSD值分别为1．18%、1．03%、1．23%、1．07%、1．32%、1．14%、1．29%、1．37%、1．41%，表明该溶液在24 h内稳定．

2．7 加样回收率试验 取10粒本品（批号20090908，其中绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA平均含量分别为0．24、2．12、1．31、8．80、1．03、0．48、0．40、0．17、0．48 mg／g）内容物，混匀，称取粉末0．5 g，精密称定，分别加（精密称取绿原酸2．40 mg、羟基红花色素A 20．00 mg、芍药苷12．00 mg、甘草苷3．20 mg、迷迭香酸4．00 mg、丹酚酸B 40．00 mg、甘草酸10．00 mg、隐丹参酮2．00 mg、丹参酮ⅡA 4．8 mg，加70%甲醇定容至20 mL，摇匀，即得）混合对照品溶液1．0 mL或2．0 mL或4．0 mL，照“2．2．2”项下方法制备供试品溶液，重复制样6份，按照“2．1”项下色谱条件测定．结果详见表2，表明该方法回收率良好．

2．8 含量测定 各批次样品中绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA含量测定：精密称10批样品，分别按“2．2．2”项下方法制备供试品，按“2．1”项下条件测定．结果，绿原酸、羟基红花色素A、芍药苷、丹酚酸B、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的平均含量（mg／粒，0．4g／粒）分别为0．243，2．139，1．321，0．316，0．414，8．815，1．033，0．173和0．487 mg／粒，RSD分别为0．80%，0．65%，0．57%，1．55%，1．79%，0．10%，0．16%，1．19%和0．79%；色谱图见图1．

3 分析和讨论

3．1 波长的选择 使用二极管陈列检测器对参花胶囊样品进行全波长扫描，主要依据每个化合物的最大吸光值与分离度，确定绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B检测波长为330 nm，芍药苷与甘草酸检测波长为230 nm，甘草苷、隐丹参酮及丹参酮ⅡA检测波长为270 nm．

表2 加样回收率试验结果

图1 不同波长的对照品与供试品UFLC色谱图

3．2 色谱条件的选择 采用梯度洗脱，选择不同品牌的反相C18色谱柱如Phenomenex Luna C18、Kro-masil C18、Ultimate○R XB C18等进行过比较，选择不同规格如（250 mm×4．6 mm，5 μm）、（150 mm× 4．6 mm，5 μm）、（75 mm×4．6 mm，5 μm）等进行比较，选择不同流动相系统如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液及乙腈-0．5%磷酸水溶液（1000 mL溶液中含2．0 g磷酸二氢钾）等，结果采用Kromasil C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）与流动相系统乙腈-0．5%磷酸水溶液（1000 mL溶液中含2．0 g磷酸二氢钾），其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，因此将此条件作为检测色谱条件．

3．3 供试品制备方法 对供试品的制备方法进行考察如溶剂选择（甲醇、水、不同浓度的甲醇）、提取方法（超声及超声时间、浸渍、加热回流）等，由于浸渍提取时间过长，加热回流提取多种物质被破坏（与超声提取比较相应时间范围内未见色谱峰出现）、而超声提取时间短色谱信息丰富．综合上述各因素选择70%甲醇超声30 min提取，得到较理想的色谱峰信息（如峰面积大、分离度好等）．

3．4 7个化合物转移率 建立方法的目的是为了检测制剂中的有效成分，而有效成分才是制剂临床疗效的保证．因此，笔者用2．1项色谱条件对药材与对应制剂（批号20130601～20130607）中绿原酸、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、芍药苷、甘草酸、甘草苷、丹参酮ⅡA的含量进行计算，得出其转移率分别为70．37%、94．12%、95．25%、32．35%、32．95%、39．91%、89．35%．结果表明芍药苷、甘草酸、甘草苷三个转移率不高，但中药作为一个复杂的分子体系，药效是多分子多靶点共同作用的结果，所以还需要对该制剂物效基础进行深入研究．

综上所述，经过试验建立了参花胶囊的UFLC含量测定方法，同时测定了10批次该制剂中的9个成分，含量均一．上述方法准确、稳定、操作简单，易于实施，同时为规范和优化本品的生产工艺，保证质量的均一性和稳定性，为达到用药安全、稳定的目的提供了理论依据，因此该方法可作为评价参花胶囊质量的有效方法之一．

［1］徐丽君，黄光英．丹参的化学成分及其药理作用研究概述［J］．中西医结合研究，2009，1（1）：45-48．

［2］金玉青，洪远林，李建蕊，等．川芎的化学成分及药理作用研究进展［J］．中药与临床，2013，4（3）：44-48．

［3］徐如英，童树洪．红花的化学成分及药理作用研究进展［J］．中国药业，2010，19（20）：86-87．

［4］阮金兰，赵钟祥，曾庆忠，等．赤芍化学成分和药理作用的研究进展［J］．中国药理学通报，2003，19（9）：965-970．

［5］张清华，张 玲．菊花化学成分及药理作用的研究进展［J］．食品与药品，2007，9（2A）：60-63．

［6］吴士杰，李秋津，肖学风，等．山楂化学成分及药理作用的研究［J］．药物评价研究，2010，33（4）：316-319．

［7］刘育辰，陈有根，王 丹，等．甘草化学成分研究［J］．药物分析杂志，2011，31（7）：1251-1255．

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Determination of nine components in Shen-hua Capsules by UFLC

XIAO Hui-Min1，KANG Xiao-Gang2，BAO Shen-Ping3，YANG Qian1，XIE Yan-Hua1，WANG Si-Wang11
Institute of Materia，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China；2Department of Neu-rology，Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China；3Out-Patient Department，Shenyang Mili-tary Region Headquarters，Shenyang 110000，China

AIM：To establish an UFLC method for simultaneous determination of Chlorogenic acid，Safflomin A，Paeoniflorin，Salvianolic acid B，Glycyrrhizic Acid，Liquiritin，Rosmarinic acid，Cryptotanshinone，TanshinoneⅡA in Shenhua Capsule，and thus provide theoretical basis for quality control of pharmaceu-tical preparations．METHODS：The Kromasil C18（250 mm× 4．6 mm，5 μm）was used，and the column temperature was maintained at 30℃．The UV detection wavelength was at 230 nm（Paeoniflorin，Glycyrrhizic Acid），270 nm（Liquiritin，Crypto-tanshinone，TanshinoneⅡA），and 330 nm（Chlorogenic acid，Safflomin A，Rosmarinic acid，Salvianolic acid B）．A gradient e-lution of acetonitri-0．5%phosphoric acid（per 1000 mL contai-ning 2．0 g Potassium Phosphate Monobasic）was adopted at the flow rate of 1．0 mL／min．The injection volume was 5 μL．RE-SULTS：The good resolution was achieved among the 9 active in-gredients．The linear ranges and RSDs of Chlorogenic acid，Saf-flomin A，Paeoniflorin，Salvianolic acid B，Glycyrrhizic Acid，Liquiritin，Rosmarinic acid，Cryptotanshinone，TanshinoneⅡA were 7．00～70．00 mg／L（r＝0．9999），40．00～400．00 mg／L（r＝0．9994），62．50～625．00 mg／L（r＝0．9998），13．00～130．00 mg／L（r＝0．9996），8．80～88．00 mg／L（r＝0．9994），50．00～500．00 mg／L（r＝0．9995），48．00～480．00 mg／L（r＝0．9995），5．00～50．00 mg／L（r＝0．9994）and 8．20～820．00 mg／L（r＝0．9994）respectively．The average recoveries（n＝6）were between 98．6%and 99．20%，and RSDs were be-tween 0．50%and 1．20%．The average amount of Chlorogenic acid，Safflomin A，Paeoniflorin，Salvianolic acid B，Glycyrrhizic Acid，Liquiritin，Rosmarinic acid，Cryptotanshinone，TanshinoneⅡA in 10 batches of preparation were 0．243，2．139，1．321，0．316，0．414，8．815，1．033，0．173，and 0．487 mg／capsule，with average RSD value being 0．80，0．65，0．57，1．55，1．79，0．10，0．16，1．19，and 0．79 respectively．CONCLUSION：The method is reliable，simple and accurate，and can be used as one of the quality evaluation methods of Shenhua Capsule．

Shenhua Capsule；HPLC；Liquiritin；Rosmarinic acid；Chlorogenic acid；Safflomin A；Paeoniflorin；TanshinoneⅡA

R286．0

A

2095-6894（2015）05-141-04

2015-04-24；接受日期：2015-05-13

陕西省科技统筹创新工程计划项目重大科技难题攻关（2011KTZB03-01-02）

肖会敏．硕士，主管药师．研究方向：中药学物效基础．Tel：029-84772165 E-mail：xhm_0908＠163．com

王四旺．E-mail：wangsiw＠fmmu．edu．cn