坐骨神经损伤端端吻合术后配合川穹嗪注射液治疗的实验研究

罗 伟，周云龙，孙振毅，马坚妹

（1山东省龙口市中医院，山东龙口265701；2大连医科大学，辽宁大连116000）

坐骨神经损伤端端吻合术后配合川穹嗪注射液治疗的实验研究

罗 伟1，周云龙2，孙振毅2，马坚妹2

（1山东省龙口市中医院，山东龙口265701；2大连医科大学，辽宁大连116000）

目的：探讨坐骨神经损伤端端吻合术后配合川穹嗪注射液治疗的实验效果．方法：选取健康SD大鼠12只，制备大鼠左侧坐骨神经切断后端端吻合模型．实验动物随机分为两组，每组6只，给药组：腹腔注射川穹嗪注射液，0．3 mg／d，共4周；对照组注射同体积的生理盐水．术后第1～4周分别进行行为学分析及坐骨神经功能指数（SFI）测定，术后第4周检测小腿三头肌湿重，并进一步截取吻合近侧段和远侧段的坐骨神经，利用免疫组化MBP髓鞘染色方法，采用Image J软件对吻合近侧段和远侧段阳性信号灰度值进行比较分析，以观察神经再生情况．结果：第4周末，给药组有部分个体足迹变短，对照组仍有个别自噬发生，两组SFI评分比较具有显著性差异（P＜0．05）；术后4周给药组小腿三头肌残存率明显高于对照组，具有显著性差异（P＜0．05）；给药组和对照组吻合口远侧段和近侧段MBP信号灰度值的比值比较无显著差异（P＞0．05）．结论：川穹嗪注射液对周围神经损伤端端吻合术后恢复具有一定的促进作用．

坐骨神经损伤；端端吻合术；川穹嗪注射液

0 引言

周围神经损伤是常见的创伤并发症，具有病程长、对患者健康损害大、治疗困难等特点．周围神经损伤后常用的手术方式有端端吻合、端侧吻合、神经移植等，端端吻合术为周围神经损伤修复的金标准．中医药在治疗周围神经损伤方面也取得了一定的成绩，川穹嗪注射液可以抗血小板凝聚和解聚已凝集的血小板，抗凝血，抗血酸形成及溶解血栓，扩张小动脉和增加心肌收缩率［1］．另外，川芎嗪可以降低血液粘稠度，减少血浆纤维蛋白原，改善血液高凝状态，增加心脑肾等重要器官的血流量作用［2］．本研究利用大鼠制作单侧坐骨神经切断端端吻合术模型，对比分析川穹嗪治疗组和对照组行为学恢复过程、坐骨神经评分、小腿三头肌湿重和轴突再生情况，探讨川穹嗪在促进外周神经损伤后再生中的作用．

1 材料和方法

1．1 实验仪器 CM3050冰冻切片机（德国LEI- CA）；Nikon 80i图像分析仪（日本Nikon）；BT-100B数显恒流泵（上海青浦西仪器厂）；FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；PHS-3C型数字式pH计（上海精密科学仪器有限公司）；MS-3 basic漩涡混合器（德国IKA）；RCT basic磁力加热搅拌器（德国IKA）；LX-100手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；SIM-F140AY65型制冰机（日本SANYO）；电热恒温干燥箱、SHZ-C型水浴恒温振荡器（上海跃进医疗器械厂）；通风柜（宁美加力有限公司）；MINI MR型搅拌器（德国IKA）．

1．2 实验方法

1．2．1 实验动物及分组 健康成年Sprague-Dawley大鼠，性别随机，体质量200～220 g（由大连医科大学实验动物中心提供），共12只，大鼠称重后随机分配为两组：给药组：单侧坐骨神经切断行端端吻合术后使用川穹嗪治疗；对照组：单侧坐骨神经切断行端端吻合术后使用等量生理盐水腹腔内．手术均在左侧后肢进行，右侧后肢作为健康空白对照．

1．2．2 手术步骤 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取俯卧位，常规备皮、消毒、固定四肢．取左侧股后斜切口，切开皮肤，于肌肉深面用小号眼科剪沿肌肉方向钝性分离暴露左侧坐骨神经，在10倍显微镜下于坐骨神经距梨状肌下缘1 cm处用显微剪剪断坐骨神经，以神经表面营养血管为解剖标志对位，即刻采用9-0无创尼龙缝合线外膜缝合4针，尽可能地保证断端对合整齐、缝线打结松紧度一致．在神经吻合处周围组织缝合一针，保留缝合线作为吻合处标记，以备二次取用坐骨神经，缝合伤口．术后肢体不固定．术后大鼠给予保暖直至麻醉苏醒．以上手术操作均在无菌条件下进行，大鼠均未给予抗生素治疗．

1．2．3 给药方法和剂量 给药组自术后第1日起，根据大鼠体重与人体比例，每天腹腔注射以2 mL蒸馏水稀释的盐酸川穹嗪约0．3 mg，每日上午一次，术后连续给药4周；对照组使用生理盐水替代．

1．3 观察指标

1．3．1 行为学分析

1．3．1．1 大体观察情况 于术后每日给药时观察大鼠伤口愈合情况，下肢活动情况，肢体末端有无破溃，伤侧足的自噬情况，对刺激的反应情况．

1．3．1．2 坐骨神经功能指数（SFI）测定 所有动物的坐骨神经功能指数在术后7、14、21、28 d进行测定．坐骨神经功能指数SFI＝0为正常，-100为完全损伤，测量足迹给药组与对照组同一天进行，每次每只大鼠测量6次，选取最清晰3次足迹作为统计资料．伤侧以爪背拖行者及足迹无法辨认者，SFI记为-100．

1．3．2 小腿三头肌湿重 大鼠给药4周后，水合氯醛过量麻醉处死大鼠．手术切开皮肤、去除皮下组织，显露两侧小腿三头肌全长，自肌肉近侧切开，完整剥离双侧坐骨神经，于腱止点处完整取下小腿三头肌，立即用电子天平测定肌湿重、记录．用手术侧肌肉湿重与正常侧肌肉湿重之比表示肌肉残存率，即残存率＝术侧腓肠肌湿重／正常侧腓肠肌湿重×100%．给药组与对照组同一天进行取材，肌肉切取后称重3次，取3次平均值作为数据记录．

1．3．3 神经再生 体式显微镜下将大鼠左侧坐骨神经从周围组织中分离，仅保留神经外膜，以手术所留缝合线头为标志确定坐骨神经吻合口，分别在距吻合部位的近侧和远侧端各1．0 cm处切取坐骨神经，切取段约长5 mm，每段神经标记近侧和远侧端，将大鼠皮肤做缝合后统一收集销毁．取上述两段坐骨神经干，于4%多聚甲醛溶液中后固定过夜，20%DEPC蔗糖水内置换过夜后，OCT包埋，神经组织采用连续冰冻矢状切片，片厚16 μm，每段神经选取3张近中间部分的完整切片用于免疫组织化学染色．免疫组化染色在切片中间部位选取3个40倍视野拍照，利用免疫组化MBP髓鞘染色方法，采用ImageJ软件对吻合近侧段和远侧段阳性信号灰度值行进比较分析，以观察神经再生情况．

1．4 统计学处理 应用SPSS11．5软件进行统计分析，结果用±s表示，采用配对比较的t检验，P＜0．05作为统计结果有显著性意义的判定标准．

2 结果

2．1 行为学分析

2．1．1 一般观察 大鼠手术后第1日即出现显著的坐骨神经功能丧失的表现，可见受损侧脚印明显变长，受损侧后腿完全麻痹而用后爪背行走的拖行步态．自第3日发现大鼠出现左足自噬情况．术后1、2、3周，手术侧足趾、足跟出现红肿、溃疡等失神经表现，给药组与对照组基本相同．自第4周开始，给药组大鼠自噬及溃疡情况有所减轻，活动增加，足印变短，给药组已无自噬情况，对照组仍有个别自噬发生．

2．1．2 坐骨神经功能指数（SFI） 在术后第1、2、3周末有明显的坐骨神经功能丧失表现，因大鼠患足无法足掌触地行走致伤足足印无法测出，故给药组和对照组SFI分数均为-100，两组无差异．第4周末，给药组有部分个体足迹变短，SFI评分为（-44．4± 16．3）分，对照组仍有个别自噬发生，说明动物感觉功能尚未恢复，SFI评分为（-99．9±8．1）分．经统计学分析两组间比较具有显著性差异（P＜0．05）．

2．2 小腿三头肌湿重 术后4周给药组小腿三头肌残存率为（0．72±0．03）%，盐水对照组为（0．67± 0．05）%，两组间具有显著性差异（P＜0．05）．

2．3 神经纤维恢复情况 术后4周，对吻合口近侧和远侧段坐骨神经行MBP免疫组化髓鞘染色．结果可见，无论是对照组还是给药组，其近侧段髓鞘均均匀一致，染色致密（图1A和1B）．而在远侧段，对照组仅见少量MBP阳性信号（图1D），给药组（图1C）虽然MBP信号较比近侧段稀疏，但是优于对照组（图1D）．为了解成功再生并通过吻合口的神经纤维数量，我们进一步将给药组和对照组吻合口远侧段和近侧段MBP信号灰度值的比值进行了比较，结果显示给药组为（0．97±0．02），对照组为（0．96±0．01）．给药组优于对照组，但无显著性差异（P＞0．05）．

图1 免疫组化染色大鼠坐骨神经髓鞘丢失情况

3 讨论

周围神经损伤是临床上比较常见的创伤并发症，虽然有多种药物及物理治疗方法，但术后神经再生速度仍旧缓慢．除手术吻合外寻找新的药物治疗方法，有效提高神经再生速度，对周围神经损伤的临床治疗具有极其重要的意义［3］．目前结合神经吻合术后使用的临床药物有西药、中药和中药复方等［4］．中药提取物作为一种新的研究方向，异军突起，具有效果确切、价格低廉、临床易推广等特点［5］．

川穹在中医中被称为血中之气药，具有活血行气、消散淤血、祛风止痛之功效［6］，其主要活性成分为川穹嗪，已有研究表明，川穹嗪具有活血化瘀，抗血小板凝集，扩张小动脉，改善微循环，抗氧化，拮抗钙离子及抗纤维化等作用［7］．川穹嗪作用机制比较复杂，目前在临床上主要应用于治疗和预防各种血管性疾病，效果较好［8］．近年来，关于川穹嗪在神经系统的损伤保护尤其是缺血／再灌注损伤中的保护作用及其机制逐渐成为热点问题而被广泛研究．研究表明，川穹嗪对神经系统缺血损伤保护治疗的作用机制主要集中以下几个方面：①改善脑血流；②抗氧化作用；③抗炎作用；④抗神经元凋亡作用［9-10］．

本研究发现川穹嗪注射液对周围神经损伤端端吻合术后再生有一定的促进作用．由于坐骨神经完全切断端端吻合后的恢复相对缓慢，并且模型所做吻合为神经外膜吻合，即对包裹在神经最外面的疏松结缔组织进行缝合，并没有进行神经束膜的吻合，因此恢复较慢，表现在最初的术后3周内，无论是对照组还是给药组SFI均为-100．术后4周开始，从行为学分析来看，给药组大鼠开始恢复，已无自噬，并且溃疡情况也有所减轻，活动增加，足印变短，而对照组仍有个别自噬发生，说明其感觉功能尚未恢复．从小腿三头肌残存率来看，术后4周给药组与对照组比具有显著性差异，说明在术后4周，给药组肌肉的萎缩程度小于对照组．根据以上结果，川穹嗪的作用似乎并不是直接作用于神经再生，而是通过保护轴突，增强雪旺细胞活性，促进吻合口周围组织的血运，改善微循环，保护运动终板、缓解感觉终器的退变和肌肉萎缩起作用．从髓鞘免疫组化染色数据分析来看，给药组与对照组无统计学差异，这一结果也在一定程度上印证了我们的猜测．以上结果表明，川穹嗪注射液对周围神经损伤端端吻合术后功能恢复具有一定的促进作用，其作用可能是通过促进血管内皮的修复，扩张小动脉，改善局部的微循环来实现的．

综上所述，川穹嗪注射液对周围神经损伤端端吻合术后恢复具有一定的促进作用．

［1］王美勇，王润生，韦宜山．周围神经损伤的药物治疗研究进展［J］．神经损伤与功能重建，2009，4（4）：285-287．

［2］魏少荫，张培训，杨德梅，等．促进周围神经再生的中药及复方［J］．中国中药杂志，2008，33（17）：2069-2072．

［3］史正亮，邵新中，马 维，等．促红细胞生成素促进坐骨神经再生的实验研究［J］．中华显微外科杂志，2011，34（2）：125-127，180．

［4］辛林伟，唐际存．神经生长因子在周围神经损伤治疗中的作用与给药途径［J］．中国医院药学杂志，2010，30（20）：1774-1776，1783．

［5］吴朝阳，张文明，张立群，等．锂剂促进周围神经损伤修复的初步研究［J］．中华手外科杂志，2011，27（2）：69-72．

［6］王世龙，林 原，唐泽耀．川穹嗪在各类神经系统损伤中的保护作用及其机制研究进展［J］．中国药理学通报，2010，26（4）：438-442．

［7］Li M，Zhao MQ，Kumar Durairajan SS，et al．Protective effect of tetramethylpyrazine and salvianolic acid B on apopotosis of rat cere-bral microvascular endothelialcell under high shear stress［J］．Clin Hemorheol Microcirc，2008，38（3）：177-187．

［8］Zhu XL，Xiong LZ，Wang Q，et al．Therapeutic time window and mechanism of tetramethylpyrazine on transient focal cerebral ischemi-a／reperfusion injury in rats［J］．Neurosci Lett，2009，449（1）：24-27．

［9］张丽霞，刘文波，柴 勇，等．川穹嗪对缺氧缺血脑损伤大鼠神经细胞凋亡的影响［J］．解剖学杂志，2009，32（3）：291-294．

［10］赵乌兰，王永华，王 枫．针刺及川穹嗪对急性药物性聋豚鼠耳蜗生长相关蛋白GAP-43表达的影响［J］．浙江中医药大学学报，2008，32（6）：793-795．

R651．3

A

2095-6894（2015）05-006-03

2015-03-22；接受日期：2015-04-08

罗 伟．硕士，主治医师．Tel：0535-8549708 E-mail：lwszwk＠163．com