BMSCs复合PHBV原位修复兔鼻中隔软骨缺损的实验研究

陈思绮 王健

·论著·

BMSCs复合PHBV原位修复兔鼻中隔软骨缺损的实验研究

陈思绮 王健

目的探索BMSCs复合PHBV原位修复兔鼻中隔软骨缺损的可行性。方法建立兔鼻中隔软骨缺损模型。将36只健康新西兰大白兔随机分成3组。实验组：软骨缺损处植入BMSCs-PHBV复合物进行修复；对照组：软骨缺损处植入单纯PHBV支架材料进行修复。空白组：单纯取出鼻中隔软骨，不予修复。分别于16、24周取材，行大体观察及组织学检测。结果大体观察显示，实验组新生软骨样组织将鼻中隔软骨缺损区填充修复，与周围软骨组织未见明显分界；对照组新生软骨薄，与周围组织分界明显；空白组鼻中隔软骨缺损区未生成软骨组织，缺损部位及其周围正常软骨组织被纤维结缔组织充填覆盖。组织学检测显示，实验组构建的软骨组织结构致密，基质及Ⅱ型胶原显色程度均明显强于对照组构建的软骨。结论BMSCs-PHBV复合物能有效修复兔鼻中隔软骨缺损。

鼻中隔软骨骨髓基质干细胞再生医学原位修复

鼻中隔位于鼻部中央，是鼻的主要支撑结构，也是构成鼻部金字塔形状的重要基础。鼻中隔软骨是鼻下2/3的最主要支撑结构，由中间薄片状的软骨（骨）及两侧的鼻黏膜构成。鼻中隔作为鼻部的中线骨架，在青少年生长发育的过程中，对鼻子以及周围面部组织的生长有重要的作用，在结构以及功能上，和侧鼻软骨共同成为内部鼻阀[1]，并对鼻部的软组织、软骨组织和鼻腔起到支撑的作用，并最终决定成年后鼻子的基本形态[2]。因此，各种先天性或获得性的鼻中隔畸形都会严重影响鼻部的功能和外形[3]，导致鼻背、鼻尖缺损和畸形，鼻小柱短小塌陷，鼻尖上翘等表现，严重者可致鼻梁塌陷，临床上称之鞍鼻畸形[2]，同时可引起不同程度的通气障碍。目前，国内外修复鼻中隔软骨缺损的各种方法均有报道，但并未达成共识。常用方法有人工假体植入、自体骨或软骨移植等[4]。但由于材料自体性质及鼻中隔部位的特殊结构等原因，以上方法均存在不足之处。如：因鼻中隔缺损继发的严重鞍鼻畸形较为复杂，一般鼻下部的自体软骨或硅胶的填充不能奏效，反而容易压迫鼻下部而致通气不畅[5]。自体骨或软骨作为移植材料，来源极为有限，不仅增加了手术痛苦，形成供区骨或软骨缺损，且存在不易雕刻、容易变形、移植后可被吸收等缺点。人工材料虽然便于雕刻塑形、不易被吸收，但其植入后产生的异物反应和感染尚未得到较好解决，且体内长期稳定性无法保证。

组织工程学在应用细胞生物学和工程学的基础上得到迅速的发展，内容涉及种子细胞、生物支架材料以及组织构建等众多研究方向，为软骨缺损的修复打开了一扇新的大门。本实验选用成年新西兰兔为实验动物，兔的鼻中隔结构由四边形鼻中隔软骨、犁骨、筛骨垂直板构成，尽管有细节上的差异，兔的鼻部解剖结构和人体还是十分相似的[6-7]。我们利用骨髓穿刺收集兔的自体骨髓基质干细胞（BMSCs），进行体外培养、扩增，种植于PHBV支架材料上；体外培养后，将BMSCs-PHBV复合物移植到原鼻中隔软骨缺损处，完成软骨缺损的修复；利用组织学染色对新生的鼻中隔软骨进行检测，为组织工程技术修复鼻中隔软骨缺损提供实验依据。

1 实验方法

1.1 实验材料及仪器

1.1.1 主要试剂

Percoll原液、Ham/F12培养基、L-谷胺酰胺、青霉素、磷酸盐缓冲液、高糖DMEM培养液、4%乙酸溶液、II型胶原蛋白酶、戊巴比妥钠、多聚甲醛、戊二醛、低糖DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶－0.2%ETDA（Sigma公司，美国）；兔抗兔Ⅱ型胶原抗体（Santa公司，美国）；胎牛血清、三抗（Hyclone公司，美国）。

1.1.2 主要仪器设备

低温高速离心机（Thermo公司，美国）；细胞培养超净台（苏净公司，中国）；电热恒温水浴锅（精宏实验设备有限公司，中国）；扫描电镜（Leica S90，日本）；Multiskan MK3全自动酶标仪（赛默飞世尔科技公司，美国）；水平摇床（SCILOGEX，美国）；细胞计数板（求精生化试剂仪器有限公司，中国）；低速自动平衡离心机（医用离心机厂，中国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，德国）。

1.2 兔鼻中隔软骨缺损模型的建立

1.2.1 动物分组

健康新西兰大白兔36只（我院动物实验中心提供），体质量2.0～3.0 K g，雌雄不限，雌性未孕，实验前分笼饲养1周。

所有动物随机分成3组。实验组：软骨缺损处植入BMSCs-PHBV复合物进行修复；对照组：软骨缺损处植入单纯PHBV支架材料进行修复；空白组：单纯取出鼻中隔软骨，不予修复。植入后16、24周取材观察。

1.2.2 模型的建立

实验兔术前禁食、水6 h。肌肉注射氯胺酮麻醉，将兔俯卧固定于实验台上，术区脱毛、消毒、铺巾。鼻中部4 cm左右纵行切口，逐层分离皮肤、皮下组织及骨膜。在鼻骨中部作2 cm左右纵行切口，確定鼻中隔位置，以鼻中隔剥离子沿鼻中隔软骨在软骨膜下分离两侧黏膜及两侧鼻软骨。用直角剪剪取0.5 cm×1 cm的鼻中隔软骨，建立鼻中隔软骨缺损模型（图1）。

图1 兔鼻中隔缺损模型的建立Fig.1 The establishment of nasal septum injury in rabbit model

1.3 BMSCs-PHBV复合物修复鼻中隔软骨缺损

1.3.1 兔骨髓间质干细胞提取和培养

抽取5 m L兔骨髓，加入10 m L低糖DMEM中，2 000 r/min离心10 min，吸除脂肪和上清液，重新振荡摇匀制成细胞悬液。将Pcrcoll分离液（2×骨髓细胞悬液，置入15 m L离心管）加入骨髓细胞悬液，2 000 r/min离心30 min，吸取有核细胞至另一离心管。加入无血清低糖DMEM培养液10 m L，2 000 r/min离心10 min，反复操作3次。以2×105cells/cm2的细胞密度接种至直径100 mm培养皿内，37℃、5% CO2、95%湿度条件下培养。48 h后除去培养皿中的液体，用PBS洗涤3次，加入10 mL含血清低糖DMEM培养液，吹打混匀后继续培养。每天换液1次。6～8 d后细胞可达到融合状态，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA进行传代。

1.3.2 BMSCs-PHBV复合物的制备

将PHBV材料裁剪为1 cm×0.5 cm大小的长方形，环氧乙烷消毒，置于6孔板中。将100μL的细胞悬液滴加在PHBV支架上，37℃、5%CO2、95%湿度下培养箱内孵育4 h后，将支架完全浸入含10% FBS的低糖DMEM培养基，继续培养72 h。

1.3.3 BMSCs-PHBV复合物植入缺损部位

将BMSCs-PHBV复合物（实验组）或PHBV支架材料（对照组）植入鼻中隔软骨缺损部位（图2）。生理盐水清洗术区与周围组织，逐层缝合，回笼饲养，肌注抗生素3 d，密切观察动物生存情况。

图2 BMSCs-PHBV复合物植入缺损部位Fig.2 The implantation of BMSCs-PHBV complication into nasal cartilage defects

1.4 实验相关检测

1.4.1 BMSCs-PHBV复合物电镜观察

取体外培养7 d的BMSCs-PHBV复合物，PBS漂洗，2.5%戊二醛固定，扫描电镜观察。

1.4.2 大体标本观察

分别在术后16周和24周时，完整取出鼻中隔软骨，观察软骨缺损区的修复情况，包括软骨形态、色泽、弹性等的观察。

1.4.3 组织学检测

分别于术后16周和24周取材。4%多聚甲醛固定24 h、脱水、石蜡包埋、切片，HE及Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察标本的组织结构、软骨基质着色及Ⅱ型胶原表达情况。

2 结果

2.1 BMSCs-PHBV复合物电镜观察

体外培养1周的BMSCs-PHBV复合物扫描电镜观察显示：完整融合成连续细胞层的BMSCs，在支架表面黏附伸展，汇合成片后覆盖在大部分材料表面，并且分泌细胞外基质（图3）。

图3 BMSCs-PHBV复合物体外培养7 d扫描电镜观察Fig.3 SEM observation of the BMSCs-PHBV complex cultured for 7 days in vitro

2.2 大体观察

术后16周，3组均可见增生的纤维结缔组织，紧贴软骨表面，难以去除。空白组见0.5 cm×0.5 cm缺损，对照组见0.1 cm×0.1 cm的缺损，实验组虽未见缺损，但其缺损处新生的软骨组织较正常的软骨组织薄（图4）。

图4 术后16周软骨缺损重建大体观Fig.4 The gross observation of the tissue engineered cartilage 16 weeks after operation

术后24周，对照组和空白组皆可见增生的纤维结缔组织，较术后16周更为严重。空白组软骨缺损处被纤维结缔覆盖，未见新生软骨组织。对照组缺损部位的新生软骨薄，且与正常软骨组织分界明显，表面覆盖纤维结缔组织。实验组的缺损部位已被新生软骨组织覆盖充填，厚薄、色泽、质地、形态与周围正常软骨组织相似，未见明显分界（图5）。

图5 术后24周软骨缺损重建大体观Fig.5 The gross observation of the tissue engineered cartilage 24 weeks after operation

2.3 鼻中隔软骨缺损部位HE染色

实验组缺损区术后16周或24周皆可见典型的软骨陷窝，内有细胞核，大多位于陷窝中央，核仁明显，周围有蓝染的细胞外基质沉积，中空现象不明显，细胞密度均匀，细胞排列规则平整，但术后16周缺损部位与周围正常软骨组织之间的界限，较术后24周更为明显。对照组缺损区，术后16周可见纤维结缔组织填充，软骨陷窝结构幼稚，中空现象明显，与周围正常软骨组织可见分界；术后24周的软骨缺损部位，完全被纤维结缔组织填充，缺损部位和周围正常软骨组织形成明显分界（图6、7）。

图6 术后16周HE染色（200×）Fig.6 The results of HE staining of nasal septal cartilage 16 weeks after operation(200×)

图7 术后24周HE染色（200×）Fig.7 The results of HE staining of nasal septal cartilage 24 weeks after operation(200×)

2.4 鼻中隔软骨缺损部位Ⅱ型胶原免疫组化染色

Ⅱ型胶原免疫组化染色示，随着培养时间的延长，对照组和实验组新生组织中软骨陷窝逐步成熟，术后24周细胞外特异性Ⅱ型胶原含量较术后16周更多。术后16周或24周，实验组新生软骨组织的软骨结构均比对照组更为成熟，细胞外基质表达更强烈，细胞密度均匀、排列规则，与周围正常软骨组织的界限也较不明显（图8、9）。

图8 术后16周Ⅱ型胶原免疫组化染色（200×）Fig.8 The results of TypeⅡcollagen immunohistochemistry of nasal septal cartilage 16 weeks after operation(200×)

图9 术后24周Ⅱ型胶原免疫组化染色（200×）Fig.9 The results of TypeⅡcollagen immunohistochemistry of nasal septal cartilage 24 weeks after operation(200×)

3 讨论

肿瘤、感染、外伤、手术等是造成鼻中隔软骨缺损或穿孔的常见原因。软骨组织本身缺乏未分化细胞，并缺少神经、淋巴和血管的分布，且致密的胶原蛋白多糖基质将软骨细胞包裹，限制其增殖和迁移。因此，损伤后自我修复能力较差[8]，常导致各种畸形和功能障碍[9-11]。

目前，对于鼻中隔缺损常用的修复方法有人工假体植入、自体骨或软骨移植等[4]。但均存在一定的缺陷。1987年Vacanti等[12]提出组织工程的概念，利用组织工程学研究和开发修复组织损伤和改善功能的生物替代品有了飞跃性的发展。软骨组织工程是指应用细胞生物学和工程学的原理，将适宜的种子细胞培养扩增后，种植于生物支架材料，用以修复软骨缺损[12-13]。Puelacher等[14]曾利用牛软骨细胞在裸鼠皮下构建了鼻中隔软骨，但其仅限于软骨形状以及透明软骨组织成分上的研究，并未用于体内修复。理想的种子细胞应取材方便、来源广泛、对供体损伤少、具有良好的增殖能力，且植入体内后不会引起免疫反应[15-16]。研究证实，BMSCs复合生物支架材料能够有效修复关节软骨缺损，相较软骨细胞，BMSCs能在各种关节微环境内分化成软骨细胞和成骨细胞，而且在诱导分化成软骨细胞的过程中，对糖氨多糖和特异性细胞外基质Ⅱ型胶原的表达能力高于ADSCs[17-19]。负重部位因为存在生物力学的刺激作用，所形成软骨组织的功能和结构更加优良，这不仅说明软骨微环境对于形成良好软骨组织非常重要，更指出BMSCs构建软骨组织的可行性。本研究中，我们经由淋巴细胞分离液（Percoll分离液）来分离提取兔骨髓中的单个核细胞，再进行体外培养。此方法分离后获得的BMSCs纯度较高，且操作快捷、简便，对细胞活性的影响小。

组织工程支架材料应具有三维多孔结构、良好的生物降解性和相容性，介导细胞在其表面的黏附、增殖，并提供良好的微环境让细胞在其表面生长、增殖、分泌基质。作为支撑和负重的结构，也应具有良好的机械强性和可塑性[20]。除了将现有材料交联配合使用外，探索新的支架材料是组织工程研究的重要方向。3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物（Poly-3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate，PHBV）是生物可降解高分子材料，其最终降解产物为H2O和CO2[21]。此支架材料用PHBV为基体，添加玉米、土豆等各类含纤维素淀粉类物质，相较天然高分子材料，具有良好的机械性和韧性；且PHBV属于天然原料合成，无化学添加剂，不产生生物毒性，具有良好的组织相容性。总之，PHBV作为支架材料具有多孔的三维结构、良好的机械强度、良好的亲水性、独特的电压性和良好的生物相容性[22]。本实验中，扫描电镜发现材料表面的细胞不仅伸展黏附良好，并分泌细胞外基质，表明PHBV支架具有良好的细胞相容性。

兔正常鼻中隔软骨的主要营养来源是软骨膜，故其自我再生修复能力低。研究表明，大于4 mm的关节软骨全层缺损一般不能自我修复，缺损部位由纤维结缔组织填充[23]。兔是鼻部研究的主要动物模型。兔的鼻中隔结构由四边形鼻中隔软骨、犁骨、筛骨垂直板构成，鼻腔的解剖结构、形状大小与人类基本相似，具有动物实验模型建立的可行性[7]。本次研究于兔鼻中隔软骨建立1 cm×0.5 cm左右的缺损模型，不破坏鼻中隔软骨周围组织。

实验中，软骨缺损区分别植入BMSCs-PHBV复合物及单纯PHBV支架材料，并在术后16周和24周取出鼻中隔软骨。经由大体标本观察可知，实验组新生的软骨组织填充软骨缺损部位，新生组织与周围软骨分界不明显，结合良好。空白组则未有软骨样组织修复，表面纤维结缔组织增生严重。

组织学染色示有透明软骨样组织形成，可见完整软骨陷窝，内有细胞核，周围有蓝染的细胞外基质沉积，细胞密度均匀，细胞排列规则平整。单独植入PHBV支架的对照组新生软骨薄，且新生软骨组织和正常软骨组织分界明显，不能完整修复，表面覆盖纤维结缔组织。组织学染色可见纤维结缔组织填充，软骨陷窝结构幼稚，中空现象明显。Ⅱ型胶原免疫组化染色显示，随着培养时间的延长，对照组和实验组的新生组织中软骨陷窝逐步成熟，细胞外基质Ⅱ型胶原含量逐渐增多。相较于对照组，实验组新生软骨组织的软骨结构也更为成熟，细胞外基质表达强烈，细胞密度均匀、排列规则，与周围正常组织界限不明显。

综合上述，BMSCs可在PHBV支架上黏附伸展，向软骨细胞分化，合成细胞外基质。此外，支架结构基本降解，未见明显的炎性浸润，表明PHBV支架材料在兔体内的生物相容性良好。今后我们将对新生软骨组织进行生物力学特性检测，进一步探索BMSCs-PHBV复合物的应用效果，为修复鼻中隔缺损提供新的策略。

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BMSCs-PHBV in the In-situ Remediation of Nasal Septal Defect in Rabbit

CHEN S iq i,WANG Jian.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth people's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:WANG Jian(E-mail:doctorwangj@hotmail.com).

Objective To explore the feasibility of the in-situ remediation of nasal septal defect in rabbit by BMSCs combing PHBV.Methods The nasal septal defects were surgically created in the 36 rabbits.The rabbits were randomly divided into 3 groups according to the repair materials.The experimental group:BMSCs-PHBV complex;the control group: only PHBV;the blank group:nothing.The specimen in each group were harvested for gross observation,HE and immunohistochemistry staining 16 and 24 weeks after operation.Results The defects were repaired by the hyline-like cartilage tissue without obvious boundary in the experimental group while the defects were repaired by thinner cartilage tissue with obvious boundary in the control group.And the defects were repaired by the fibrous tissues in the blank group. Histology and immunohistochemistry demonstrated that the cartilage formed have more compact tissue structure in the experimental group.The cartilage matrix staining of cartilage formed in the experimental group were stronger than that of cartilage formed in the control group.Conclusion BMSCs-PHBV complex could repair defects of nasal septal cartilage in rabbits effectively.

Nasal septal cartilage;Bone marrow stroma stem cells;Regenerative Medcine;In-situ remediation

R765.3，Q813.1+2

A

1673－0364（2015）01－0001－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.01.001

2014年10月8日；

2014年12月10日）

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

王健（E-mail：doctorwangj@hotmail.com）。