中药蝉花菌株筛选及发酵条件优化研究

陈显群，羊 悦，杨胜利*

（1.温州市食品研究所，浙江温州325000；2.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014）

中药蝉花菌株筛选及发酵条件优化研究

陈显群1，羊 悦2，杨胜利2*

（1.温州市食品研究所，浙江温州325000；2.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014）

目的：从蝉花中分离真菌，并采用液体培养考察菌丝收率。方法：在单因素实验基础上，利用正交实验设计，对蝉花菌液态深层发酵条件如摇床转速、接种量、pH等进行了优化。结果：最优的发酵工艺为初始pH 7.0、摇床转速160 r/min、发酵温度25℃。结论：优化发酵工艺条件下蝉花菌发酵生物量为6.57 g/L。

蝉花；液态深层发酵；分离

0 引言

蝉花属虫生性药用真菌，是我国传统名贵中药材，又名蝉蛹草、蝉茸、胡蝉、蜩等，与冬虫夏草同属于菌物界、真菌门、子囊菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，具有广泛的生物活性。中医药学家认为，蝉花具有疏散风热、透疹、熄风止痉、明目退翳之功效。现代医学研究表明，它具有免疫调节[1-3]、抗疲劳抗衰老[4-5]、抗肿瘤[6-8]、改善肾功能[9]、促进造血功能[10]、镇静催眠[11]、滋补强壮[12]等作用。由于蝉花与冬虫夏草同属虫菌复合体，且具有相近的药用价值，所以医家常将蝉花作为冬虫夏草的代用品。由于蝉花生长需要特定的生态环境和寄主昆虫，资源稀少，再加上长期采挖，资源日趋枯竭。开展人工分离、培养及液体发酵培养菌丝体的研究是未来的一个发展方向。近些年对冬虫夏草的研究较多，而对蝉花的研究甚少，蝉花具有与冬虫夏草相似的化学成分，故蝉花可能具有与冬虫夏草相似的药用价值，从而为蝉花作为冬虫夏草的替代品提供了理论依据[13-16]。

1 材料与方法

1.1 蝉花采自浙江安吉竹博园

1.2 培养基

分离培养基:马铃薯20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%，琼脂粉2%。121℃灭菌20 min。

种子培养基:马铃薯20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%。121℃灭菌20 min。

液体发酵培养基:马铃薯提取液20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.4%，MgSO40.05%，K2HPO40.1%，酵母膏0.2%，维生素B1 0.002%。121℃灭菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离

称取5 g天然蝉花样品，分别取自僵虫体、子座芽和孢子，加入到45 mL无菌生理盐水中，振荡30 min。梯度稀释，从各稀释液中吸取0.1 mL到筛选平板并涂布，置于25℃恒温培养箱中培养3～5 d。挑选单个典型的菌落，接种到PDA斜面培养基中，保存备用。

1.3.2 菌种鉴定

用点接法将蝉花真菌接种到PDA平板上进行菌落形态观察，通过显微镜作个体形态观察。

1.3.3 种子培养

250 mL摇瓶装液量50 mL，接种斜面菌块，置于摇床中，转速160 r/min，25℃培养4 d。

1.3.4 发酵培养条件的影响

经初步试验选定pH值、发酵温度、摇床转速作为主要影响因素，以发酵后菌丝体生物量为指标，在单因素试验的基础上采用三因素三水平正交设计试验，对蝉花菌株发酵条件进行优化研究。

1.3.4.1 pH值的影响

在250 mL锥形瓶中装入100 mL发酵培养基，按5%种子液接种，pH值分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，25℃培养5 d，发酵结束后，4000 r/min离心，测定菌丝体量。

1.3.4.2 温度的影响

固定其他条件，考查发酵培养温度分别为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃时对蝉花发酵生物量的影响。

1.3.4.3 摇床转速的影响

固定其他条件，考查摇床转速分别为120、140、160、180、200 r/min时对蝉花发酵生物量的影响。

1.3.4.4 正交设计优化

针对发酵过程中pH值、温度和转速对菌丝体生长的影响，选定这3个因素，进行正交实验L9（33），其因素和水平见表1。

表1 发酵条件因素水平表Table 1 Factors and levels of fermentation condition

1.3.5 生物量测定

采用干重法。发酵液经4000 r/min离心15 min去除上清液，菌丝体用去离子水洗涤3次后离心，置于烘箱内60℃烘干至恒重后称重。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离与鉴定

按照1.3.1方法分离出多株菌株，其中在子座芽中分离的一株长势良好。经分离纯化后，点接在PDA平板中观察该菌落形态。发现刚开始菌落圆形呈白色，起初星状放射生长、菌丝平伏，与培养基结合紧密，不易挑取，继续培养颜色逐渐加深，最终呈紫色。在显微镜下观察该菌个体形态，发现菌丝有隔，基部无足细胞。分生孢子梗生于气生菌丝上，具简单分枝，由单侧生、对生的瓶状小梗组成。瓶梗较短，基部膨大和具管状的颈部，可初步判定其为蝉拟青霉。

2.2 发酵条件对蝉花菌丝体生长的影响

2.2.1 pH值对蝉花发酵生物量的影响

一般来讲，pH值过低菌体易衰老，pH值过高易使菌体自溶。本实验研究了不同的培养基pH值对菌体生长的影响，结果如图1所示。由图1可以看出，就生物量而言，出发菌株随着初始pH值的升高出现先上升后下降的变化，在初始pH为7.0时，达到最大值；在初始pH为6.5和pH为7.0时生物量变化不明显，分别是6.24 g/L和6.27 g/L。

图1 培养初始pH值对生物量的影响Fig.1 Effects of initial pH on biomass

图2 培养温度对生物量的影响Fig.2 Effects of culture temperature on biomas

2.2.2 培养温度对蝉花发酵生物量的影响

对微生物发酵培养来说，温度的影响是双方面的:温度升高，可以加快微生物的生长，但是随着温度的上升，细胞中对温度敏感的酶可能会遭到破坏，而且温度过高，菌体易老化，影响到菌丝体生长及其他代谢产物的积累。一般的较适于真菌生长的温度范围为25℃～30℃，据报道菌丝在10℃～30℃下均能生长。本实验选择温度范围在20℃～30℃之间，考察对菌丝体的生长影响。由图2可以看出，在26℃时的生物量最大，而低于20℃或高于30℃对菌丝体的生物量影响较大，由于长势肉眼便可直观辨别，因此没有进一步研究的必要。因此选定蝉花菌丝生长的最适合的发酵温度为26℃，菌株生物量达到最大值6.42 g/L。

2.2.3 摇床转速对蝉花发酵生物量的影响

由表3可以看出，摇床转速为160 r/min时蝉花菌丝生物量达到最大，菌丝在液体中生长需要消耗氧气，随着摇床转速的提高，液面接触空气的面积增大，利于溶解氧水平的增加；摇床转速继续增加，剪切力增加，菌丝不断被切断，形成新的菌丝球萌发点，从而生长出新的菌丝球；但摇床转速过大，菌丝难以在高速振荡情况下会导致菌丝损伤严重，难以维持正常的生长，因而影响整个生物量，所以摇床转速以160 r/min左右为宜。

图3 药瓶转速对生物量的影响Fig.3Effects of shaking speed on biomass

2.2.4 pH值、温度、摇床转速正交试验

为考察不同发酵条件对菌丝体生长的影响，在单因素试验基础上，试验选pH值、温度、转速等3因素，进行L9（33）正交试验，在参考已知文献及前期试验的基础上，以生物量为评价指标，优化液态深层发酵工艺。按照表1设计的正交实验，考察了不同发酵条件对蝉花菌丝体的生长的影响，结果示于表2。由此得出优选实验方案为A2B2C2。摇床转速与溶氧浓度有关。溶氧对菌丝体生长有影响。由于氧在水中的溶解度很小，因此氧往往成为发酵过程的限制性因素。摇床转速慢，氧在发酵液中的溶解度就小，在发酵进入对数期后，易造成溶氧不足，影响了菌丝体的生长；摇床转速快，增加了溶氧量。温度对菌丝体的生长具有重要影响，25℃时菌丝体生长迅速，最后得到的生物量高。pH影响代谢过程中各种酶的活性，pH=7.0有利于菌体的生长。

表2 冬虫夏草液态深层发酵正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment design in submerged fermentation conditions of Cordyceps sinensis

表3 方差分析Table 3Analysis of variance

从以上的方差分析可知，各因素对蝉花菌丝体生成量的影响大小顺序为A（温度）＞B（pH）＞C（转速），三个因素对结果的影响有统计学意义。最终确定冬虫夏草菌丝体的富硒量的最佳工艺条件为A2B2C2，即pH值为7，温度25℃，转速为160 r/min。

2.3 最佳工艺验证试验

在单因素和正交试验优化的基础上，进行验证试验。结果表明，在培养5 d的条件下，蝉花菌液态深层发酵最优工艺参数：装液量100 mL，pH值7.0，摇床频率为160 r／min，温度25℃。此时蝉花发酵生物量为6.57 g／L。

3 结论

通过对蝉花菌丝体发酵条件的优化研究，发现其工艺的优化是一个非常复杂的动态过程，影响其结果的因素也很多，通过单因素试验和正交试验取得了较好的效果，结合方差分析得到反应条件的最佳点，在此条件下，蝉花发酵生物量为6.57 g／L。本试验找出了蝉花菌丝的最佳发酵条件，为以后的研究提供了一定的基础，今后可进一步选育出优良的蝉花菌株应用到发酵生产中。

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Study on Separation and Fermentation Culture of Strain of Cordyceps Cicadae

CHEN Xian-qun1,YANG Yue2,YANG Sheng-li2
（Wenzhou Food Research Institute,Wenzhou，Zhejiang 325000,China；The College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou，Zhejiang 310014,China）

Objective:The strain isolated from Cordyceps cicadae and its fermentation culture were studied,mycelia yield was investigated by submerge fermentation.Methods:Single factor examination and orthogonal experiment design were used to investigate the effects of pH,temperature,shaking speed on the biomass of the Cordyceps cicadae.Results:The optimal fermentation conditions:initial pH 6.0,shaking speed 160 r/min,fermentation temperature 25℃.Conclusion:The biomass of Cordyceps cicadae is 34.98 g/L under the optimized fermentation process.

Cordyceps cicadae;submerged fermentation;isolation

1006-4184（2015）2-0018-04

2014-07-04

陈显群（1965-）,男，高级工程师，研究方向为食品营养。E-mail：wzspyjs@163.com。

*通讯作者：杨胜利（1972-）,男，副教授，博士，研究方向为微生物制药。E-mail：yangshengli01@zjut.edu.cn。