干扰乳酸脱氢酶A表达对肝癌HepG2细胞增殖与迁移的影响

司素华，熊二梦，杜凤仪，彭琬昕，龚爱华

（1.如皋市中医院检验科，江苏如皋226500；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

干扰乳酸脱氢酶A表达对肝癌HepG2细胞增殖与迁移的影响

司素华1，熊二梦2，杜凤仪2，彭琬昕2，龚爱华2

（1.如皋市中医院检验科，江苏如皋226500；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的：观察靶向乳酸脱氢酶A（1actate dehydrogenase-A，LDHA）的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）对肝癌HepG2细胞系的干扰效率及其对细胞增殖与迁移的影响。方法：设计合成LDHA及对照eGFP shRNA序列，克隆至真核表达质粒pLKO.1-TRC，质粒抽提纯化后测序鉴定。重组质粒用脂质体转染肝癌细胞系，采用反转录（RT）-PCR和免疫印迹检测LDHA的表达，验证shRNA的干扰效率。采用CCK-8和克隆形成实验检测干扰LDHA后细胞增殖的变化，划痕实验检测干扰LDHA对细胞迁移的影响。结果：成功构建针对LDHA和对照eGFP的shRNA表达质粒。与转染sh-eGFP组相比，转染sh-LDHA组HepG2细胞中LDHA mRNA和蛋白表达水平明显降低（P均＜0.05）。与sh-eGFP组相比，sh-LDHA组72，96 h细胞增殖明显降低，克隆形成数减少，细胞迁移距离短（P均＜0.05）。结论：LDHA的干扰质粒能有效干扰LDHA在肝癌HepG2细胞中的表达，明显抑制HepG2细胞的增殖活力和迁移能力。

肝细胞肝癌；乳酸脱氢酶A；RNA干扰

肝细胞肝癌简称肝癌，在世界致死性肿瘤中位居第三，每年死亡人数约70万［1］。由于肝癌患者确诊晚、伴有肝病和缺乏有效的治疗方式，只有30％～40％患者适合治疗［2］。瓦伯格效应（Warburg Effect）是指癌细胞生长很快，使得细胞经常处于一种缺氧状态，于是癌细胞就关闭了线粒体的有氧氧化，通过葡萄糖无氧酵解提供能量的现象。肿瘤细胞依赖糖酵解产生ATP，抑制糖酵解干扰能量代谢治疗肿瘤成为可能［3］。瓦伯格效应的最后一步是丙酮酸经乳酸脱氢酶A（1actate dehydrogenase-A，LDHA）催化转变为乳酸。研究表明LDHA在胰腺癌、胃癌等多种肿瘤中异常表达，与肿瘤发生、进展有关［4］。但LDHA在肝癌细胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨干扰人肝癌HepG2细胞中LDHA的表达后细胞增殖与迁移的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库；pLKO.1-TRC环形质粒（美国Addgene公司）；DMEM及胎牛血清（美国Gibco公司）；LipofectamineTM2000和Stb13感受态细胞（美国Invitrogen公司）；细胞计数试剂盒，简称CCK-8（美国Sigma公司）；内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和T4连接酶（美国Neb公司）；总RNA抽提用Trizo1、RNA反转录试剂盒、PCR试剂盒及胶回收试剂盒（日本TaKaRa公司）；质粒大提及小提试剂盒（美国Omega公司）；鼠抗人α-微管蛋白抗体、兔抗人LDHA抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和羊抗人二抗（美国Biowor1d公司）；引物及测序由上海生工生物公司完成。

1.2 细胞培养及质粒的瞬时转染

人肝癌细胞HepG2接种于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。传代24 h后按照LipofectamineTM2000推荐的操作步骤转染质粒。细胞转染24 h后用0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液用于后续实验。

1.3 干扰质粒构建

登录www.broad.mit.edu/genome_bio/trc/rnai. htm1网站搜索与pLKO.1质粒相兼容的LDHA shRNA序列，上游序列：5′-CCGGGCCTGTGCCATCAGTATCTTACTCGAGTAAGATACTGATGGCACAGGCTTTTTG-3′，下游序列：5′-AATTCAAAAAGCCTGTGCCATCAGTATCTTACTCGAGTAAGATACTGATGGCACAGGC-3′；对照eGFP shRNA上游序列：5′-CCGGTACAACAGCCACAACGTCTATCTCGAGATAGACGTTGTGGCTGTTGTATTTTTG-3′，下游序列：5′-AATTCAAAAATACAACAGCCACAACGTCTATCTCGAGATAGACGTTGTGGCTGTTGTA-3′，由上海生工合成，按Moffat等［5］报道的方法构建sh-RNA表达载体，构建好的载体经测序确认。

1.4 反转录（RT）-PCR

在转染后48 h Trizo1法提取转染细胞总RNA， RT-PCR检测各组细胞LDHA mRNA的表达，灰度值分析LDHA的干扰效率。LDHA的上游引物为5′-CCAACATGGCAGCCTTTTCC-3′，下游引物为5′-TCACGTTACGCTGGACCAAA-3′，扩增产物片段为149 bp；GAPDH的上游引物为5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物为5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′，扩增产物片段为121 bp；PCR反应条件为94℃预变性2 min，然后进入以下28个循环：94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。循环完毕，72℃延伸5 min。取5 μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳。SmartGe1凝胶成像分析系统成像，Lane 1D Ver 4.0软件进行半定量分析。

1.5 免疫印迹检测蛋白表达

质粒转染72 h后提取蛋白，行10％SDSPAGE，转膜，封闭，洗膜。4℃孵育一抗过夜，LDHA抗体按1∶1 000稀释，α-微管蛋白抗体（内参）按1∶10 000稀释，二抗1∶10 000稀释，室温孵育1 h，用化学发光试剂显示阳性条带，图像分析，每组实验重复3次。

1.6 CCK-8实验

将细胞以1 000个/孔接种于96孔培养板（100 μL/孔），每组6孔，于培养箱培养。于24、48、72、96 h，每孔分别加10 μL CCK-8溶液，培养箱中继续培养2 h后，酶标仪于450 nm波长检测每孔光密度（D）值，记录结果，绘制生长曲线。

1.7 克隆形成实验

细胞以500个/孔接种于6孔板中常规培养，连续培养14 d，经固定、结晶紫染色后，在显微镜下计数，记录含有50个细胞以上的克隆数量。

1.8 划痕实验

细胞以50 000个/孔接种于24孔板中，待接近形成细胞单层时，用10 μL枪头在24孔板内均匀划直线，PBS洗涤3次；加入含1％胎牛血清的培养基继续培养48 h，分别测量0 h和48 h划痕宽度，平均迁移距离=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/2。

1.9 统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组sh-LDHA和sh-eGFP质粒

构建好的干扰质粒sh-LDHA和对照质粒sheGFP经测序确认，与设计完全相符。

2.2 转染干扰质粒后LDHA mRNA和蛋白表达

结果见图1和图2，与sh-eGFP组细胞相比，sh-LDHA组LDHA mRNA表达水平明显降低，下降了76.6％（t=6.045，P＜0.05）；蛋白表达水平也明显降低，下降了82.6％（t=7.007，P＜0.05）。由此表明，LDHA干扰效果明显。

图1 RT-PCR检测LDHA mRNA的表达

图2 蛋白质印迹检测LDHA蛋白的表达

2.3 干扰LDHA后细胞增殖活力和克隆形成能力的改变

如图3所示，干扰HepG2细胞中LDHA的表达，与sh-eGFP组相比，sh-LDHA组细胞增殖逐渐减慢，转染72 h后两组D值差异有统计学意义（t= 5.840，P＜0.05），96 h时sh-LDHA组细胞增殖活力受到明显抑制，抑制率为64.5％。

图3 两组HepG2细胞的增殖能力比较

克隆形成实验结果显示（图4），sh-eGFP组克隆数为（429.3±19.8），而sh-LDHA组克隆数为（204.0±10.4），差异有统计学意义（t=18.557，P＜0.05），表明干扰LDHA可以明显抑制肝癌细胞增殖。

图4 两组HepG2细胞克隆形成的比较

2.4 下调LDHA表达对细胞迁移能力的影响

划痕实验结果见图5，sh-eGFP组平均迁移距离是（211.3±17.1）μm，而sh-LDHA组平均迁移距离是（83.7±4.9）μm，差异具有统计学意义（t=6. 026，P＜0.05），由此表明，干扰LDHA能明显抑制HepG2细胞的迁移能力。

图5 两组HepG2迁移能力的比较

3 讨论

LDHA是糖酵解途径中将丙酮酸转化为乳酸的关键酶，是糖酵解途径的关键检验点，高表达于多种类型的肿瘤，包括淋巴瘤、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌和黑色素瘤等。LDHA的表达与肿瘤的增殖、维持与侵袭转移密切相关。在小鼠模型的研究中已经表明，肿瘤细胞依赖于LDHA而正常组织细胞依赖于氧化磷酸化，敲除LDHA的小鼠癌旁细胞增殖速率约是癌细胞的100倍，而过表达LDHA则可逆转该增殖抑制［10］。另外，Xie等［11］研究表明LDHA在肺癌A549细胞侵袭转移中起重要作用。因此，抑制LDHA的表达可能限制肿瘤的能量供应，从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移能力。肝癌是发展迅速的实体瘤，肿瘤中存在大片的缺氧区域，同时患者血浆中乳酸活性较健康人异常增强，提示肝癌细胞存在糖酵解活性增强的现象。本研究结果显示，降低LDHA的表达可明显抑制肝癌细胞HepG2的增殖与转移能力，与Rong等［4］报道在胰腺癌中下调LDHA表达可抑制肿瘤增殖活力与转移一致。LDHA遗传缺陷患者只有在剧烈运动后才会出现肌红蛋白尿症［10］，因此，在正常情况下抑制LDHA的表达可能不会出现严重不良反应，LDHA有望成为癌症治疗的靶点。

综上，本研究结果显示干扰LDHA后肝癌细胞HepG2的增殖活力及转移能力受到了明显的抑制，但其作用机制尚需进一步研究。

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Effects of LDHA knockdown on proliferation and migration of HepG2 cells by RNA interference

SI Su-hua1，XI0NG Er-meng2，DU Feng-yi2，PENG Wan-xin2，G0NG Ai-hua2
（1.Department of Laboratory Medicine，Rugao Hospita1 of Traditiona1 Chinese Medicine，Rugao Jiangsu 226500；2.Medica1 Co11ege of Jiangsu University，ZhenJiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To exp1ore the pro1iferation and migration effects of 1actate dehydrogenase-A（LDHA）short hairpin RNA（shRNA）on hepatoce11u1ar carcinoma HepG2 ce11s.Methods：LDHA and eGFP shRNA sequences were designed and inserted into pLKO.1-TRC p1asmid.HepG2 ce11s were transfected with the recombinant p1asmids that were identified by sequencing.Reverse transcription（RT）-PCR and Western b1otting were used to eva1uate the si1encing effect，CCK-8 experiment and c1one formation assay for pro1iferation，wound hea1ing assay for migration.Results：In HepG2 ce11s，LDHA shRNA significant1y reduced the expression of LDHA，the efficiency of si1encing were 76.6％and 82.6％on the transcription of LDHA gene and the expression of LDHA protein respective1y.Compared with the sh-eGFP group，sh-LDHA group showed decresed ce11uar vitab1it1y，1ower 1eve1s of the formed c1ones，shorter migration distance（both P＜0.05）.Conclusion：LDHA shRNA was successfu11y constructed and cou1d effective1y knockdown target gene in HepG2 ce11s.Inhibition of LDHA expression evident1y resu1ted in inhibition of HepG2 pro1iferation and migration.

hepatoce11u1ar carcinoma；1actate dehydrogenase-A；RNA interference

R735.7

A

1671-7783（2015）06-0487-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150180

2015-08-14 ［编辑］刘星星

司素华（1979—），男，江苏如皋人，主管检验师，主要从事肿瘤细胞生物学的研究。