转录因子KLF6对大鼠趋化因子CCL5基因启动子活性的影响及其可能的结合部位

刘 玉，虞天一，张 婧，何风霞，卢燕来，周梦雅，王璐璐，赵 聃，邱 文，王迎伟

（南京医科大学免疫学系，江苏南京210029）

转录因子KLF6对大鼠趋化因子CCL5基因启动子活性的影响及其可能的结合部位

刘 玉，虞天一，张 婧，何风霞，卢燕来，周梦雅，王璐璐，赵 聃，邱 文，王迎伟

（南京医科大学免疫学系，江苏南京210029）

目的：构建大鼠趋化因子CCL5基因启动子（全长和截短）荧光素酶报告质粒，检测大鼠肾小球系膜细胞（g1omeru1ar mesangia1 ce11，GMC）中过表达Kruppe1样转录因子6（Kruppe1-1ike factor 6，KLF6）对CCL5基因启动子活性的影响。同时，筛选KLF6与CCL5基因启动子区的结合位点。方法：采用PCR技术，将扩增出的大鼠CCL5基因启动子全长序列（-1744nt～-14nt）插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中，获得CCL5基因启动子全长荧光素酶报告质粒（pGL3-CCL5-FL）。然后，将pGL3-CCL5-FL与大鼠野生型KLF6表达质粒（pIRES2/KLF6）共转染GMC，测定其荧光素酶活性。另用生物信息学软件预测CCL5基因启动子上KLF6潜在的结合位点，并据此构建出4个CCL5基因启动子截短的荧光素酶报告质粒（即pGL3-CCL5-1～4）。将上述CCL5基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒分别与KLF6过表达质粒共转染GMC，再行荧光素酶活性的测定，初筛KLF6可能的结合部位。结果：菌液PCR以及核酸测序结果证实，上述所有启动子荧光素酶报告质粒均构建成功。pGL3-CCL5-FL和pIRES2/KLF6共转染GMC结果显示，CCL5基因启动子的活性显著增强。pGL3-CCL5-FL、pGL3-CCL5-1～4分别与pIRES2/KLF6共转染GMC后发现，pGL3-CCL5-4的启动活性显著降低。提示KLF6可能结合在CCL5基因启动子的-343nt～-191nt区域。结论：本实验成功构建了大鼠CCL5基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒，并初步筛查出KLF6在CCL5基因启动子上可能的结合部位在-343nt～-191nt区域。

Kruppe1样转录因子6；CCL5；肾小球系膜细胞；荧光素酶报告质粒；启动子活性

大鼠Thy-1肾炎（Thy-1 nephritis）是人类系膜增生性肾小球肾炎（mesangina1 pro1iferative g1omeru1onephritis，MsPGN）的动物模型［1］，其病理变化与人类MsPGN的病变十分相似。大鼠Thy-1肾炎病变的肾组织中多种炎症和趋化因子（如TNF-α、CCL2）产生增多［2-4］，并且肾小球内也有巨噬细胞和CD4+T细胞的浸润［5-6］，提示Thy-1肾炎肾组织的炎症因子与组织的炎症反应和损伤密切相关。

以往的研究表明，亚溶解型C5b-9复合物与Thy-1肾炎病变过程有一定的联系［7］。已知亚溶解型C5b-9能刺激靶细胞，触发一系列生化反应，在胞内激活多条信号通路，产生不同的应激效应，如分泌细胞炎症介质和细胞因子、刺激增生以及诱导或抑制凋亡等［8-9］。有研究报道亚溶解型C5b-9刺激肾小球系膜细胞（g1omeru1ar mesangia1 ce11，GMC）之后，可激活某些信号通路，导致炎症介质与细胞因子的大量释放。GMC受亚溶解型C5b-9刺激后，产生的炎症或趋化因子和介质除涉及某些信号转导通路的活化，也可通过某些核转录因子的表达上调，进而启动炎性相关基因的表达。在多种上调的转录因子中，Kruppe1样转录因子6（Kruppe1-1ike factor 6，KLF6）在Thy-1肾炎大鼠肾组织内和体外用亚溶解型C5b-9刺激的GMC中均见上调，并且KLF6可以调控某些炎症反应［10-11］。故本实验拟以KLF6为切入点，探讨其与Thy-1肾炎大鼠肾组织趋化因子上调间可能的关系。

我们的前期研究已证实，Thy-1肾炎大鼠早期肾组织中KLF6、趋化因子CCL5的表达均显著增加，且CCL5动态变化的趋势与KLF6的变化趋势基本一致，但是，两者之间的关系有待进一步的研究。本实验首先观察KLF6过表达对大鼠GMC分泌CCL5的影响，然后在大鼠的GMC中共转染大鼠CCL5基因启动子（全长和截短）的荧光素酶报告质粒与KLF6过表达质粒，研究KLF6能否影响CCL5基因启动子的活性，并筛选CCL5基因启动子上KLF6可能结合的区域。这将为我们后期深入研究Thy-1肾炎大鼠肾组织炎性病变中CCL5基因的功能与作用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠GMC HBZY-1细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。双荧光素酶报告基因检测试剂盒、荧光素酶报告质粒pGL3-basic与内参照质粒pRL-SV40为美国Promega公司产品。组织基因组DNA提取试剂盒和PrimeSTAR®GXL DNA聚合酶均为日本TaKaRa公司产品。限制性内切酶MiuⅠ，XhoⅠ和T4DNA连接酶（美国NEB公司）。ELISA试剂盒为上海朝瑞生物有限公司产品。Neon细胞电转仪（MPK5000，美国Invitrogen公司）。本课题组前期已构建KLF6过表达质粒（pIRES2/KLF6），并在GMC中能成功表达。

1.2 方法

1.2.1 设计大鼠CCL5基因启动子引物序列并扩增 在基因库数据库中，搜索大鼠CCL5 DNA序列，寻找该基因的转录起始位点ATG，由此向上游确定一段序列。同时，应用引物设计软件Primer 5.0辅助设计CCL5基因启动子区（-1744nt～-14nt）的引物。应用预测转录因子结合位点软件Jaspar预测KLF6在CCL5基因启动子区域可能的结合位点。再根据软件预测结果设计CCL5基因启动子各截短的引物，以大鼠基因组DNA为模板，扩增大鼠CCL5基因启动子全长和截短的序列。引物序列见表1（上游划线处为MiuⅠ酶切位点，下游划线为XhoⅠ酶切位点，CG、CC分别为上游和下游酶切位点的保护性碱基）。

1.2.2 提取及鉴定大鼠肾组织总DNA 大鼠肾组织基因组DNA根据组织基因组DNA提取试剂盒的说明书中详细步骤进行提取。DNA的含量和纯度采用紫外/可见分光光度仪测定，D（260 nm）/D（280 nm）在1.8～2.0之间。DNA的完整性用琼脂糖电泳鉴定。

1.2.3 构建与鉴定大鼠CCL5基因启动子全长和截短质粒 用限制性内切酶MiuⅠ和XhoⅠ双酶切pGL3-basic以及上述不同的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳回收，并纯化线性化的pGL3-basic和酶切后的PCR产物。之后，将酶切后的pGL3-basic与PCR产物在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接反应过夜。连接完成后，将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，均匀涂布于含氨苄西林抗性的LB平板上，置于恒温箱37℃培养10～12 h。从LB平板上挑取3个单克隆菌落分别接种于5 mL含氨苄西林的LB培养液中，220 r/min 37℃恒温摇床培养10～12 h。取1 μL上述培养液，用上述引物分别进行PCR扩增，根据PCR结果筛选出阳性克隆质粒再送南京金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定。鉴定正确后，将构建的质粒命名为pGL3-CCL5-FL（全长）、pGL3-CCL5-1（1号截短）、pGL3-CCL5-2（2号截短）、pGL3-CCL5-3（3号截短）和pGL3-CCL5-4（4号截短）。

表1 扩增大鼠CCL5基因启动子全长和截短的引物序列

1.2.4 重组质粒转染大鼠GMC 大鼠GMC传代培养36 h后，消化细胞并用Neon细胞电转系统将上述CCL5基因启动子全长和各截短质粒与pIRES2/KLF6共转染到GMC中。以1×105个/孔接种于24孔板，其中各组均转染内参照质粒pRLSV40，并且设pGL3-basic与未转染组为对照组。

1.2.5 测定荧光素酶的活性 质粒转染GMC后48 h，1×PBS轻柔洗涤1次，加入裂解液裂解，置于振荡器震荡15min，收集裂解物于管中。用荧光检测仪对上述CCL5基因启动子的荧光素酶活性进行测定。在测量管中加入20 μL细胞裂解液，再加入50 μL LARⅡ试剂测定目的基因的萤火虫荧光素酶活性（标记为M1），而后加入50 μL Stop&G1o试剂测定内参pGL-SV40质粒的海肾荧光素酶活性（标记为M2），被测质粒的相对荧光素酶活性（简称RLU）即M1/M2。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。所得数据均以均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonfferoni检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠CCL5基因启动子荧光素酶报告质粒的鉴定

根据大鼠CCL5基因启动子全长引物序列，以大鼠基因组DNA为模板，用PCR扩增出CCL5基因启动子全长（-1744nt～-14nt）。经双酶切，连接过夜，转化涂板以及挑单克隆摇菌后，进行菌液PCR反应，筛选出阳性克隆（图1），随后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。结果表明，大鼠CCL5基因启动子全长荧光素酶报告质粒构建成功（命名为pGL3-CCL5-FL）。

2.2 KLF6过表达对大鼠GMC分泌CCL5的影响

将对照空质粒pIRES2及pIRES2/KLF6分别转染GMC，48 h后收集上清，ELISA检测CCL5的蛋白分泌情况。结果显示，过表达KLF6后的GMC中CCL5分泌量显著高于未转染组和转染空质粒组（图2）。这一结果表明KLF6能够促进CCL5蛋白的表达。

1：未转染组；2：pIRES2组；3：pIRES2/KLF6组a：P＜0.01，与未转染组和pIRES2组比较图2 KLF6过表达对大鼠GMC分泌CCL5的影响

2.3 KLF6过表达对大鼠CCL5基因启动子全长活性的影响

实验分组如下：①pGL3-basic+pIRES2/KLF6和pRL-SV40共转染；②pGL3-CCL5-FL+pIRES2/ KLF6和pRL-SV40共转染；③pGL3-CCL5-FL+ pIRES2和pRL-SV40共转染。转染后48 h裂解细胞，检测各组的荧光素酶活性。结果显示，pGL3-CCL5-FL+pIRES2/KLF6组的RLU值明显高于其他两组（图3）。结果提示在GMC中，KLF6过表达能够启动CCL5基因的转录。

1：pGL3-basic+pIRES2/KLF6和pRL-SV40组；2：pGL3-CCL5-FL+pIRES2/KLF6和pRL-SV40组；3：pGL3-CCL5-FL +pIRES2和pRL-SV40组a：P＜0.01，与pGL3-basic+pIRES2/KLF6组比较；b：P＜0.01，与pGL3-CCL5-FL+pIRES2组比较图3 KLF6对大鼠CCL5基因启动子全长活性的影响

2.4 大鼠CCL5基因启动子各截短荧光素酶报告质粒的鉴定

同CCL5基因启动子全长荧光素酶报告质粒构建方法相同，如图4所示，菌液PCR筛选出阳性结果，以下各截短与其目的片段大小均相吻合。将测序的结果与NCBI上报告序列进行比对，显示两者序列与插入方向正确。表明大鼠CCL5基因启动子各截短荧光素酶报告质粒均构建成功。

M：DNA标准参照物；1：pGL3-CCL5-1；2：pGL3-CCL5-2；3：pGL3-CCL5-3；4：pGL3-CCL5-4图4 CCL5各截短荧光素酶报告质粒菌液PCR鉴定

2.5 KLF6过表达对大鼠CCL5基因启动子各截短活性的影响

将CCL5基因启动子全长pGL3-CCL5-FL和各截短pGL3-CCL5-1、pGL3-CCL5-2、pGL3-CCL5-3和 pGL3-CCL5-4荧光素酶报告质粒及pGL3-basic分别与pIRES2/KLF6和pRL-SV40质粒共转染到GMC，检测各组荧光素酶活性。结果显示，pGL3-CCL5-FL、pGL3-CCL5-1、pGL3-CCL5-2和pGL3-CCL5-3质粒转染组的RLU值均明显高于pGL3-basic质粒转染组，而pGL3-CCL5-4质粒转染组的RLU值与pGL3-basic质粒转染组无统计学差异，同时pGL3-CCL5-4质粒转染组的RLU值较pGL3-CCL5-FL、pGL3-CCL5-1、pGL3-CCL5-2和pGL3-CCL5-3质粒转染组显著降低（图5）。结果表明，在CCL5基因启动子-343nt～-191nt区域可能存在KLF6的结合位点。

1：pGL3-CCL5-FL；2：pGL3-CCL5-1；3：pGL3-CCL5-2；4：pGL3-CCL5-3；5：pGL3-CCL5-4；6：pGL3-basica：P＜0.01，与pGL3-basic比较；b：P＜0.01与pGL3-CCL5-4比较图5 KLF6过表达对大鼠CCL5基因启动子各截短活性的影响

3 讨论

Thy-1肾炎的肾组织损伤具有补体C5b-9，尤其是亚溶解型C5b-9复合物的依赖性。C5b-9是补体激活后的效应产物，也是Thy-1肾炎GMC损伤的主要因素［12］。亚溶解型C5b-9插入有核细胞膜后，虽不直接造成细胞溶破，却能激活细胞内多条信号转导通路，使细胞发生多种生物学行为的改变。

我们之前的实验已观察到，在早期发病的大鼠Thy-1肾炎肾组织内以及体外用亚溶解型C5b-9刺激的GMC中，转录因子KLF6和趋化因子CCL5的mRNA和蛋白的表达明显增加，且CCL5的表达趋势基本与KLF6同步。文献报道［10，13］，KLF6可参与巨噬细胞的炎症应答；Fischer等［14］研究发现，KLF6表达可见于输尿管胚芽及其分支和集合管上，这些结果提示KLF6在肾脏发育和炎症反应中可能起关键的作用。目前已知KLF6作为一种转录因子，其羧基端DNA结合区的结构可特异性与GC盒和CACCC盒结合，促进下游靶基因（胎盘糖蛋白、TGF-β受体）的转录［15］。

在大鼠Thy-1肾炎发病早期的肾组织中，KLF6与CCL5虽同步上调，但两者之间的关系并不清楚。我们前期在大鼠的GMC中过表达KLF6，结果发现KLF6能上调CCL5的表达，提示KLF6能够促进CCL5蛋白的表达。在本研究中，我们构建了大鼠CCL5基因启动子全长荧光素酶报告质粒（pGL3-CCL5-FL），与pIRES2/KLF6质粒共转染到GMC中，结果显示，KLF6能明显上调荧光素酶活性，表明KLF6作为一个转录因子确能启动CCL5基因的转录。

本研究设计并成功构建了CCL5基因启动子不同截短荧光素酶报告基因（pGL3-CCL5-1～4），并分别将其与KLF6共表达。结果显示，pGL3-CCL5-4组的活性明显低于其他各组。表明KLF6在CCL5启动子上的结合区域可能位于-343nt～-191nt。荧光素酶报告实验只能初筛转录因子的结合部位，因此，仍需通过染色质免疫共沉淀以及启动子突变等实验对两者具体的结合区域加以准确定位。

综上所述，本研究初步证实了KLF6能与趋化因子CCL5基因的启动子结合调控其转录表达。这一实验结果为今后研究亚溶解型C5b-9刺激GMC诱导CCL5转录及其调控机制提供了必要的实验依据。

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Construction of chemokine CCL5 promoter plasmid and identification of its binding sequence with KLF6

LIU Yu，YU Tian-yi，ZHANG Jing，HE Feng-xia，LU Yan-iai，ZH0U Meng-ya，WANG Lu-iu，ZHA0 Dan，QIU Wen，WANG Ying-wei
（Department of Immuno1ogy，Nanjing Medica1 University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

Objective：Construction of 1uciferase reporter with the fu11-1ength and truncated promoters of rat CCL5 gene to detect their interaction with Kruppe1-1ike factor 6（KLF6）in rat g1omeru1ar mesangia1 ce11 and identity the possib1e binding sites for KLF6.Methods：The potentia1 binding sites of KLF6 in CCL5 promoter were predicted with bioinformatics software.Rat fu11-1ength（-1744nt～-14nt）and different truncated CCL5 promoter were amp1ified by PCR and inserted into the 1uciferase reporter pGL3-basic p1asmid and named after pGL3-CCL5-FL and pGL3-CCL5-1～4 respective1y.The pGL3-CCL5-FL，pGL3-CCL5-1～4 and KLF6 expression p1asmid（pIRES2/KLF6）were co-transfected into GMC.The 1uciferase activity was detected.Results：The 1uciferase reporters of pGL3-CCL5-FL，pGL3-CCL5-1～4 were we11 constructed by PCR ana1ysis and identified with nuc1eotide sequencing.The resu1ts of 1uciferase assay showed that the transcriptiona1 activity of CCL5 gene was increased in response to KLF6 overexpression when co-transfected with pGL3-CCL5-FL or pGL3-CCL5-1～4，but the 1uciferase activity was remarkab1y1ower within pGL3-CCL5-4 transfecion，indicating that the region of rat CCL5 promoter（-343nt～-191nt）might contain KLF6 binding e1ement.Conclusion：KLF6 regu1ates the expression of CCL5 via targeting at its promoter region-343nt～-191nt.

kruppe1-1ike factor 6（KLF6）；CCL5；g1omeru1ar mesangia1 ce11；1uciferase reporter p1asmid；promoter activity

R393

A

1671-7783（2015）06-0461-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150189

2015-08-28 ［编辑］ 何承志

国家自然科学基金资助项目（81471626，31500701）；江苏省自然科学基金资助项目（BK20140910）

刘玉（1990—），女，硕士研究生；王迎伟（通讯作者），教授，E-mai1：wangyw1508@njmu.edu.cn