均匀设计法优化鱼头多糖提取工艺的研究

陈宏硕，高建胜，柏松，刘晓宁，刘安军

（1.河北联合大学电气工程学院，河北唐山063009；2.河北联合大学冀唐学院，河北唐山063009；3.天津科技大学，天津300457）

均匀设计法优化鱼头多糖提取工艺的研究

陈宏硕1，高建胜2，柏松2，刘晓宁3，刘安军3

（1.河北联合大学电气工程学院，河北唐山063009；2.河北联合大学冀唐学院，河北唐山063009；3.天津科技大学，天津300457）

本课题选取淡水鱼鲤鱼鱼头为实验材料，用弱碱法提取多糖并运用均匀设计法对其工艺参数乙醇浓度、料液比、提取时间进行优化分析，确定最佳工艺条件为乙醇浓度75%，料液比1∶5.5，提取时间13 h；DEAE Sephadex A-25柱纯化鱼头多糖，通过紫外全波长扫描与红外图谱定性分析初步确定鱼头多糖为一种类似于硫酸软骨素、通明质酸的粘多糖类物质。

鱼头多糖；均匀设计；提取纯化

鱼头中含有丰富的多糖、蛋白质、脂肪、磷脂、牛磺酸、硫酸软骨素等多种可预防或治疗疾病的功能物质。研究证实，日本北海道食品加工中心从大马哈鱼头中已成功提取分子量为300道尔顿的纯活性肽，并用其制成口服液，此口服液有抑制血压上升，且能长期稳定血压的功效。鱼头骨中含有能促进人体生长发育的天然优质钙和多种微量元素，如各种鲨鱼，安康鱼的鱼头软骨中含有的多糖类物质软骨素，具有抗动脉硬化、冠心病、偏头痛的作用，现已研制出系列功能性食品［1-3］。本文主要对鱼头多糖提取的工艺过程参数进行优化处理，DEAE Sephadex A-25柱纯化鱼头多糖，通过紫外全波长扫描与红外图谱定性分析鱼头多糖，从而为进一步开发鱼头多糖的功能性食品提供前期理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲤鱼鱼头：水产市场购买；氢氧化钠、乙醇、苯酚、硫酸：北京奥利化学试剂公司；DEAE-葡聚糖凝胶A-25：上海索莱宝生物科技有限公司；硫酸软骨素标品：美国sigma公司产品。

1.2 主要仪器与设备

JM-L50型立式胶体磨：上海科劳机械设备有限公司；HW·SY21-K4电热恒温水浴锅：北京长风仪器厂；Sp-2120型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；付立叶变换红外光谱仪：瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼头多糖的提取工艺研究

鱼头多糖的提取工艺路线［4-5］：鱼头用胶体磨磨碎→1%甲醇浸泡24 h，除脂→浸于弱碱性氢氧化钠溶液，搅拌至充分溶解→离心弃去滤渣，取上清溶液，过滤得滤液→弱酸滴定至pH=5，产生沉淀→离心除沉淀，得上清液→旋转蒸发浓缩（50℃）得浓缩液→浓缩液用savag法除蛋白→乙醇沉淀→离心得产物A→95%的乙醇洗涤除盐，过DEAE Sephadex A-25柱洗脱→冷冻干燥得产物B。

1.3.2 鱼头多糖含量测定

苯酚—硫酸法：准确称取葡聚糖20 mg，加蒸馏水定容至500 mL，取8个干净的试管分别称取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸馏水定补至2.0 mL，然后加6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静置10 min，混合均匀后，室温放置20 min。以蒸馏水做空白，于490 nm测吸光度，制作标准曲线。取样品0.1 g/L的溶液1 mL，按照标准曲线项下的方法测吸光度，按下式计算多糖含量：

多糖含量/%=标准曲线查出的浓度/样品浓度× 100%

1.3.3 鱼头多糖的DEAE Sephadex A-25纯化

取savag法脱蛋白后的多糖20 mg溶于2 mL水中，上柱。采用梯度洗脱，洗脱液为蒸馏水和NaCl，在梯度洗脱仪中分别用水和1 mol/L的NaCl不断混合，使NaCl浓度不断增大，流速10 mL/h，分别收集洗脱液（30 min/管），各管用苯酚-硫酸法测多糖，以洗脱管数为横坐标，多糖含量（以A490计）为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干。

1.3.4 鱼头多糖的紫外扫描图谱分析

根据紫外扫描原理［6］，因为核酸和蛋白分别在260 nm和280 nm处有吸收。所以就可根据在260 nm和280 nm处是否有吸收来证明多糖中是否含有核酸和蛋白，从而能从一定水平上证明多糖的相对纯度。

1.3.5 鱼头多糖的红外图谱分析

参照陈培榕［6］的方法：

1）制样：压片，样品扫描次数10次，背景扫描次数10次，分辨率8.00 cm-1

2）实验步骤：称取100 mg～150 mg干燥的KBr，研磨至均匀粉末装到模具中，放到压片机压制成透明薄片，该片作为空白片；将1 mg～2 mg试样与100 mg～150mg干燥的KBr研细均匀，置于模具中，用5×107Pa～10×107Pa压力在油压机上压成透明薄片，即可用于红外光谱测定。试样和KBr都应经干燥处理，研磨到粒度小于2 μm，以免散射光影响，波数范围4 000 cm-1～400 cm-1。

2 结果与分析

2.1 均匀设计实验结果

均匀设计是在正交试验基础上建立的优选方法。均匀设计选用正交设计中的优点来安排试验，试验次数少，而且可以通过逐步式线形及非线形回归分析，将每一水平选出。我们根据前期试验研究结果，选定提取用的乙醇浓度、料液比、搅拌时间作为考察的3个因素，分别细分各再取9个水平，以测定要提取多糖的含量为指标，选用U9（96）均匀设计表进行试验，以确定出该方法的最优最合理的提取条件，均匀设计方案见表1、表2、表3、表4。（提取液NaOH浓度为1 mol/L，提取温度为30℃）

表1 均匀设计水平表Table 1 The table level of homogeneous design

表2 U9（96）均匀设计表Table 2 The homogeneous design table of U9（96）

表3 U9（96）使用表Table 3 The uniform design table of U9（96）

表4 均匀设计因素水平表Table 4 The factor levels table of homogeneous design

图1 均匀设计确定最优提取条件的管状图Fig.1 The tubular figure of optimum extraction by homogeneous design

从图1中可以得出以下结论，提取该物质最佳条件为乙醇浓度75%，料液比1∶5.5，提取时间13 h。按均匀设计得到的最佳提取条件进行试验，每100 g鱼头中可提取鱼头粗多糖达到131.7 mg。

2.2 鱼头多糖含量分析

取含0.1 g/L样品的溶液1 mL，按照1.3.2方法测定吸光度，然后计算出多糖含量。单因素实验测定提取物鱼头粗多糖含量最高56.69%，而提取条件优化后结果显示提取物鱼头粗多糖含量为63.17%，多糖含量相比提高了6.48%。

2.3 鱼头多糖的DEAE Sephadex A-25纯化结果

鱼头多糖的DEAE Sephadex A-25纯化结果见图2。

图2 未纯化鱼头多糖过DEAE Sephadex A-25柱得到的峰值图Fig.2 The peak figure of unpurified fish head polysaccharides through DEAE Sephadex A-25

由图2可见，未纯化鱼头多糖过DEAE Sephadex A-25柱，在第9管附近出现了吸收最大值，因此我们取第8、9、10管洗脱液冷冻干燥，得到纯化后的鱼头多糖，用苯酚-硫酸法测定多糖含量，测得鱼头多糖含量为92.8%。

2.4 鱼头多糖的定性鉴定

2.4.1 纯化鱼头多糖的紫外全波长扫描

纯化后鱼头多糖紫外吸收特征曲线见图3。

图3 纯化后鱼头多糖紫外吸收特征曲线Fig.3 The characteristic curve of ultraviolet absorption about purified fish head polysaccharides

由图3分析得出，纯化鱼头多糖经紫外全波长扫描后，在260 nm处没有出现核酸的特征峰，280 nm处也没有出现蛋白的特征峰，结合测定的多糖含量92.8%，可以推断出纯化后的鱼头多糖基本不含蛋白等杂质，无须进一步纯化，可以用其进行后续研究。

2.4.2 纯化鱼头多糖红外光谱实验结果

纯化鱼头多糖红外光谱实验结果见图4。

图4 鱼头多糖与硫酸软骨素红外图谱对照图Fig.4 The infrared spectrum diagram about fish head polysaccharides and chondroitin sulfate

参照糖类化合物的光谱分析［7-8］，从图4可推断出：

3 600 cm-1～3 200 cm-1的宽峰为O-H，C-H2，C-H3的伸缩振动。

2 934 cm-1处峰为C-H伸缩振动，且比较弱，1 409 cm-1处为C-H变角振动（通常在1 400～1 500之间）。此三处为一般糖类物质的特征吸收峰。

1 651 cm-1～1 537 cm-1为C=O和C-N伸缩振动及612 cm-1处有吸收峰，表明此糖可能为氨基多糖。

1 080 cm-1左右为O-H和C-O伸缩振动。

1 237 cm-1为S=O伸缩振动（在硫酸软骨素中，此峰为强峰，而在我们的提取物鱼头多糖中，比较弱）。

由此推断，鱼头多糖可能同硫酸软骨素，透明质酸等属于同一类物质，即粘多糖。

3 结论

1）通过均匀设计实验最终确定鱼头多糖的最佳提取工艺参数，即乙醇浓度75%，料液比1∶5.5，提取时间13 h；此条件下提取的多糖含量为63.17%，比单因素条件下提取的最高多糖含量相比提高了6.48%。

2）通过DEAE Sephadex A-25柱纯化鱼头多糖，测得鱼头多糖含量92.8%。并利用紫外全波长扫描及红外色谱分析对鱼头多糖做定性鉴定，初步推断出鱼头多糖同硫酸软骨素，透明质酸等属于同一类物质，即粘多糖。

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Study on Extraction Process of The Fish Head Polysaccharides by Homogeneous Design Optimization

CHEN Hong-shuo1，GAO Jian-sheng2，BAI Song2，LIU Xiao-ning3，LIU An-jun3
（1.College of Electrical Engineering，HeBei United University，Tangshan 063009，Hebei，China；2.Jitang College of HeBei United University，Tangshan 063009，Hebei，China；3.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The carp head was selecIed as materials in order to study the extraction process of fish head polysaccharides，and the extraction of weak alkali for fish head polysaccharides was studied in this paper. Through the homogeneous design optimization，the optimum process parameters were extracted for 75%ethanol concentration、1∶5.5 dosage liquor rate and 13 h.The fish head polysaccharides was purified by DEAE Sephadex A-25 chromatographic column.Through the Uv wavelength scanning and the Infrared spectrum analysis，the fish head polysaccharides was were determined as the similar of chondroitin sulfate and hyaluronic acid.

fish head polysaccharides；homogeneous design；extraction and purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.017

2013-11-21

河北省高等学校科学技术研究项目（Z2014003）

陈宏硕（1981—），男（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：功能性食品及食品检测。