复合氨基酸与锌的螯合研究

周燕芳，郑泽玲，许丽丽

（韩山师范学院化学系，广东潮州521041）

复合氨基酸与锌的螯合研究

周燕芳，郑泽玲，许丽丽

（韩山师范学院化学系，广东潮州521041）

使用中性蛋白酶对鱼蛋白粉进行酶解，以酶解后得到的氨基酸与锌离子标准溶液螯合制备复合氨基酸锌，并对制备过程反应液的pH、摩尔比、反应时间等条件对螯合反应的影响进行了研究。结果表明：在反应液pH为6、氨基酸与锌的摩尔比为3∶1、反应时间为40 min，所得的螯合率为83.58%。并用红外光谱鉴定了产品。

中性蛋白酶；鱼蛋白；复合氨基酸；锌离子；螯合

我国水域辽阔，鱼类资源十分丰富，鱼类营养价值高，蛋白质含量丰富，是一种优质动物蛋白资源，深受人们喜欢。随着近年来市场对鱼产品多样化的需求增加，加速了我国鱼类加工业的发展。在目前，海洋捕捞所得的小杂鱼类的产量不断增加，占到渔获物的28%。此外，随着对水产品加工研究的深入，其加工比例将会越来越大，产生的下脚料也会越来越多，例如，生产100 t冷冻鱼糜约需400 t原料鱼，但要产生200 t～250 t下脚料。这些下脚料中除了含有大量的蛋白质，还含有多种生物活性物质。如何深度开发这些资源，对于水产品加工综合利用具有重要意义，而且也能支持和促进水产捕捞和养殖生产的发展［1-2］。

人体机体缺锌会导致基础代谢下降、蛋白质利用率降低、食欲与消化功能低下、影响生长发育等多方面的负面影响［3］。据统计，占世界人口17.3%的人群处于锌缺乏状态［4］。机体缺锌主要是两个方面的因素：一是食物中的锌吸收抑制剂的存在，二是食物中锌含量或吸收不足［5］。近年研究成果发现，真正在体内发挥作用的是有机锌而不是无机锌［3］。而鱼蛋白经过酶解，分解成被小肠直接吸收的小肽与一些具有生理功能的活性肽及部分游离氨基酸，与锌离子螯合生成肽和氨基酸锌。但是由于生产微量元素氨基酸螯合物成本较高也是制约其发展的因素，因此开发新工艺、新方法的研究尤为重要［6］。本试验对酶解复合氨基酸锌的制备进行了研究，以期为小杂鱼类和水产品加工下脚料的进一步开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜低值海鱼：购于潮州市桥东市场；木瓜蛋白酶：BR，江西锐阳生物科技有限公司，酶活力80万U/g；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

800型离心机：上海手术器械厂；电子天平；SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；SHP501超级恒温槽：上海恒平科学仪器有限公司；KDN型调温电热套：常州国华仪器有限公司；电子天平：上海精密科学仪器有限公司；半微量凯氏定氮仪：泰兴市铭泰科教仪器设备有限公司；WQF-400傅立叶红外光谱仪厂商：北京瑞利分析仪器公司。

2 方法和工艺流程

2.1 方法

总氮采用凯氏定氮法［7］；

氨基态氮采用双指示剂甲醛滴定法［8］；

锌含量的测定采用EDTA滴定法；

锌的螯合率（%）=（螯合物中锌的含量/反应体系中锌的含量）*100%

产品的测定红外光谱法［9］。

2.2 工艺

2.2.1 原料预处理

将新鲜鱼蒸熟→溶剂萃取脱去脂肪→65℃干燥→研细→鱼粉（供酶解用）。

2.2.2 酶解流程［10-11］

将鱼粉称量→加酶、加水→调节pH→调温→进行酶解→灭酶→离心→得到酶解液（取酶解液测定游离氨基氮含量）。

2.2.3 螯合工艺流程

酶解液→调节pH→加锌离子→调温→螯合一定时间→浓缩→乙醇析出→干燥→复合氨基酸锌。

3 结果与分析

3.1 鱼粉的酶解实验

称取适量鱼粉，加入用量为0.5%的中性酶，按底物浓度3.5%的量加水后搅拌均匀，调节pH为7，置于55℃水浴加热4 h移至沸水中灭酶10 min，离心取上清液即为酶解液。通过双指示剂甲醛滴定法测得酶解液中游离氨基氮的摩尔浓度为0.039 mol/L。

3.2 复合氨基酸锌的螯合研究

3.2.1 单因素实验结果及分析

3.2.1.1 不同pH对螯合反应的影响

在室温（25℃）下，配制氨基酸与锌离子的摩尔比为3∶1，分别在pH为5、5.5、6、7的条件下进行螯合，反应50 min后，对螯合液进行浓缩、加无水乙醇处理，使复合氨基酸锌以沉淀析出，然后干燥，并对锌离子浓度进行测定。计算出螯合率，以研究pH对鳌合反应效果的影响，结果如图1。

图1 pH对螯合反应的影响Fig.1 Effect of pH on the chelating reaction

从图中可以看出，复合氨基酸与锌离子的螯合，在不同pH条件下螯合率大小不一样，由于pH过大的话，锌离子容易形成沉淀，所以在弱酸性条件下，进行螯合是比较合适的。

3.2.1.2 摩尔比对螯合反应的影响

在室温下，pH为7，分别配制氨基酸与锌离子的摩尔比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的四种反应混合液进行反应，50 min后对混合液进行处理，并对锌离子浓度进行测定，计算螯合率，以研究摩尔比对螯合反应的影响，结果见图2。

图2 摩尔比对螯合反应的影响Fig.2 Effect of mole ratio on the chelating reaction

从图2的结果可以看出，复合氨基酸与锌离子的螯合，在不同摩尔比的情况下螯合率不一样，在复合氨基酸与锌离子的摩尔比为3∶1时螯合率达到最大，可见氨基酸与锌离子在物质的量比为3∶1时有较好螯合，因此，选用3∶1作为氨基酸与锌离子的最佳螯合摩尔比。

3.2.1.3 反应时间对螯合反应的影响

在室温下，分别配制4份氨基酸与锌离子摩尔比均为3∶1的反应液，并调节pH为7，进行螯合反应，反应时间分别为30、40、50、60 min，反应结束后按照2.2中的过程进行螯合率的测定，以研究时间对鳌合反应的影响，结果如图3所示。

图3 反应时间对螯合反应的影响Fig.3 Effect of reaction time on the chelating reaction

从图3可以看出，螯合反应一开始随着时间的增加，在30 min～50 min内呈上升趋势，当时间超过50 min后，螯合率不再增加，可见，从经济角度出发，螯合时间选定在50 min以内比较合适。

3.2.2 最佳螯合条件的研究

3.2.2.1 正交实验分析［12］

在单因素实验基础上，为了研究pH、摩尔比、螯合时间对螯合反应的综合影响，采用pH5～7、氨基酸与锌的摩尔比2∶1～4∶1、反应时间40 min～60 min的进行L9（33）三因素三水平正交试验，以找出最佳螯合条件，正交结果见表1。

表1 正交试验结果和极差分析表Table 1 Orthogonal experiment and variance analysis table of the results

从表1可看出，3种因素对螯合率的影响大小顺序为摩尔比＞pH＞反应时间，九组试验中螯合率最大的试验组合是A2B3C1，为81.21%。而根据均值正交结果分析，最佳试验组合为A2B2C1，但该组合没出现在正交表里，因此要进行验证性实验。

3.2.2.2 最佳螯合条件验证

最佳螯合条件组合为A2B2C1，即pH6、氨基酸与锌的摩尔比为3∶1、反应时间为40 min，在这三个条件下进行验证实验，通过实验得出在该条件组合下螯合率为83.58%，大于9组正交实验中最大的螯合率81.21%，所以该正交实验成功。因此最佳螯合条件为A2B2C1，即pH6、氨基酸与锌的摩尔比为3∶1、反应时间为40 min。

3.3 产物的红外图谱分析［13］

以KBr为分散剂，对反应产物与鱼蛋白粉进行红外图谱分析，结果如图4和图5所示。

图4 鱼蛋白粉的红外光谱图Fig.4 Infrared spectrum of fish protein powder

图5 产品的红外光谱图Fig.5 Infrared spetrum of product

由红外图谱可知，产物的红外图谱增多，且谱带发生移动。由红外光谱的-NH-键在3300cm-1～3000cm-1出现吸收峰，可知鱼蛋白粉的-NH-键的吸收峰出现在3 292.49 cm-1，而产品的-NH-键出现在3 298.28 cm-1，波数变大，向短波移动。而红外光谱中C=O键在1 680 cm-1～1 750 cm-1出现吸收峰，知鱼蛋白粉的C=O键的吸收峰在1 649.14 cm-1，而产品的C=O键出现在1 647.21 cm-1，波数变小，向长波移动.表明了-NH-键和C=O键发生了化学反应，锌与给电子的N形成来了配位键，又与给电子的羰基中的氧配位形成五元环。

4 结论

本试验通过中性酶水解鱼蛋白粉，在用量为0.5%的中性酶、按底物浓度为3.5%、酶解pH为7、酶解时间为4 h、酶解温度为55℃的条件下酶解得到酶解液。

通过单因素实验和正交试验相结合的方法，探究pH、摩尔比、反应时间对螯合反应的影响，得出了复合氨基酸与锌离子的最佳螯合条件是A2B2C1，即pH为pH6、氨基酸与锌离子的摩尔比为3∶1、反应时间为40 min，螯合率最高可达到83.58%。

利用红外光谱法对鱼蛋白粉和产品进行检测，发现产品的-NH-键的吸收峰向短波移动，C=O键的吸收峰向长波移动，两种化学键发生了化学反应，锌离子和-NH-和C=O形成五元环，合成了氨基酸锌螯合物。

本研究利用低值鱼蛋白经过酶解，获得游离氨基酸与锌离子发生螯合反应生成氨基酸锌。最佳的螯合率可达83.58%，说明低值鱼蛋白对我们的利用价值很高，是很丰富的蛋白质资源，本研究对于进一步提高低值鱼蛋白的附加值甚至对于更有效利用水产资源有一定的意义。

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Study on Chelating Compound Amino Acid and Zinc Ion

ZHOU Yan-fang，ZHENG Ze-ling，XU Li-li（Chemical Deparment，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

Compound amino acid were obtained from the hydrolysis of fish protein with neutral protease，and were chelated with zinc ion.The chelating conditions were studied.The effects of pH，molar ratio，reaction time on the chelating reaction were investigated.The results showed that when the pH of the reaction solution was 6，the molar ratio was 3∶1，and the time was 40 minutes，the percent chelation was over 83.58%.The product was characterized by IR.

neutral protease；compound amino acid；zinc ion；chelate；synthesis condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.003

2013-12-15

韩山师范学院青年基金项目（LQ201101）

周燕芳（1979—），女（汉），高级实验师，本科，研究方向：蛋白质的酶解。