葡萄梗多酚物质的提取和成分分析

李浡，李双石，兰蓉，王晓杰，郭珊

（北京电子科技职业学院，北京100029）

葡萄梗多酚物质的提取和成分分析

李浡，李双石*，兰蓉，王晓杰，郭珊

（北京电子科技职业学院，北京100029）

分别采用溶剂浸提法、索氏回流法、超声提取法及微波提取法提取葡萄梗中的多酚物质，并利用高效液相色谱技术分析葡萄梗中多酚物质的组成及其含量。测定的加标回收率在94.5%～98.5%，RSD在1.3%～2.1%，该方法的准确度及精密度较好。结果表明，葡萄梗中含量较高的多酚成分为绿原酸（5.70 mg/g～13.24 mg/g）和白藜芦醇（2.22 mg/g～6.71 mg/g），微波提取法提取5 min的葡萄梗中多酚物质的效果较好，本研究可为葡萄梗多酚物质的提取提供参考。

葡萄梗；多酚；高效液相色谱法

多酚活性物质是一类具有生物活性的天然化合物，是植物在生长发育中重要的次生代谢产物，具有清除自由基和抗氧化等生物活性作用［1］，还具有提高免疫功能，抗衰老［2］，预防心脑血管疾病、抗突变、抗肿瘤、消炎、防治冠心病与中风等多种药理功能［3］。葡萄中含有大量的多酚物质，主要集中在葡萄皮、籽、梗中，而关于葡萄梗中的多酚物质的研究报道并不多［2，4-5］。葡萄梗作为生产葡萄酒第一道工序中的废弃物，由于大量被丢弃，对环境造成一定的污染。因此提取葡萄梗中的多酚物质，既能减少环境污染，又能充分利用资源。

高效液相色谱法（HPLC）是测定多酚物质的常用检测方法，目前关于测定多酚的流动相主要有甲醇和乙腈两种。本文主要利用乙腈-冰醋酸水溶液作为流动相，优化流动相条件，对溶剂浸提、微波、超声、索氏等不同提取方法提取的葡萄梗样品中的多酚物质。参照有关葡萄酒渣的多酚物质检测文献［2，6-8］，故确定对葡萄梗中的儿茶素、阿魏酸、绿原酸、槲皮素、白藜芦醇、没食子酸、鞣花酸等多酚物质进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将赤霞珠葡萄梗样品烘箱烘干后，研碎，过60目筛即得供试原材料葡萄梗样品。

儿茶素、阿魏酸、绿原酸、槲皮素、白藜芦醇、没食子酸、鞣花酸标准品，上海如吉生物科技发展有限公司；乙腈（色谱纯）、冰醋酸（色谱纯），北京化工厂；水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱分析仪：美国安捷伦公司；Hypersil C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm i.d）；9960A超声清洗器：美国CBL光电子技术有限公司；KQ2200DB型超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司

1.3 试验条件

流动相：A：乙腈，B：1%冰醋酸的水溶液；采用梯度洗脱程序：0～8.0 min，20%A；8.0 min～12.0 min，30% A；12.0 min～22.0 min，40%A；22.0 min～32.0 min，12% A；流速：1.0 mL/min；柱温为：25℃；检测波长：280 nm。

1.4 标准溶液的配制

准确称取标准品儿茶素、没食子酸、槲皮素、白藜芦醇、鞣花酸、阿魏酸、绿原酸各10.0 mg，用甲醇溶解配制成1 mg/mL的标准贮备液，备用。

1.5 样品的制备

1.5.1 有机溶剂提取法

将原料与60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混匀后，于50℃水浴分别浸提30 min和60 min。浸提完成后，3 000 r/min，离心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚样品。

1.5.2 索氏提取法

将原料与60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混匀后，加热70℃分别回流60 min及120 min，回流溶液减压回收乙醇至无味，即得葡萄梗多酚样品。

1.5.3 超声辅助有机溶剂提取法

将原料与60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混匀后，于50℃，分别超声提取30 min和60 min后3 000 r/min离心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚样品。

1.5.4 微波辅助有机溶剂提取法

将原料与60%乙醇按料液比（g∶mL）1∶16.5混匀后，置于400 W～500 W微波条件下分别处理30 s、1 min和5 min，后于50℃水浴浸提60 min。浸提完成后，3 000 r/min离心5 min，收集上清液，即得葡萄梗多酚样品。

2 结果与分析

2.1 优化色谱条件

本实验尝试选择乙腈-水、乙腈-冰醋酸溶液、甲醇-水等溶液作为流动相，其中甲醇方案因文献整体反应效果比乙腈差，故放弃。乙腈-水的分离效果也较差，最后选定乙腈和1%的冰醋酸溶液作为流动相。对不同的流动相条件进行测定，具体的洗脱条件见表1。

表1 流动相洗脱条件Table 1 The elution conditions of？mobile phase

根据多酚标准品混合物以及葡萄梗提取样品的出峰情况，选择最佳的梯度洗脱条件，条件4的谱图分离最好，图1为多酚混合标准品的分离谱图，基本达到基线分离。

图1 多酚混合标准品色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of polyphenol standards

2.2 标准曲线和检测限的测定

根据液相色谱优化的梯度条件，对不同浓度的没食子酸、儿茶素、阿魏酸、槲皮素、绿原酸、白藜芦醇、鞣花酸等混合标准品溶液分别进样。根据不同浓度的标准品溶液，分别作出这7种标准品的标准曲线，得出相应的回归方程，线性相关系数及最低检测限见表2。

表2 多酚标准品的线性回归方程，相关系数以及最低检测限Table 2 The equations of linear regression，correlation coefficients and lowest detectable limits of polyphenol standards

2.3 加标回收率和精密度的测定

为了测定方法的准确性，在一定量的样品中加入标准样品，平行测定5次，计算出加标回收率以及精密度，结果详见表3。

表3 加标回收率及精密度测定Table 3 Recoveries and precision

2.4 样品的测定

根据1.5样品制备得到的9种样品，按照优化的液相色谱条件，得到葡萄梗中多酚物质的液相色谱图，样品1的谱图见图2。

图2 样品1的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of sample 1

分别测定不同方法制备得到的葡萄梗样品中多酚含量，结果见表4。

表4 多酚物质含量（mg/g）Table 4 The contents of polyphenols in samples（mg/g）

由表4可知，不同提取方法测得的多酚物质的含量各不相同。在葡萄梗样品中测得的7种多酚物质，绿原酸和白藜芦醇的含量较高，含量分别为5.70 mg/g～13.24 mg/g和2.22 mg/g～6.71 mg/g。白藜芦醇是葡萄梗中含量较高的物质，只是不同地区不同品种的葡萄之间含量差异很大，Karacabey［9］以及Raynea［10］等测定的葡萄藤茎中白藜芦醇的含量为3.45 mg/g～4.25 mg/g，与本文测定的白藜芦醇含量比较接近。白藜芦醇是具有芪类结构的一种非黄酮类多酚化合物，是植物受到应激时自身合成的一种抗毒素［11］。白藜芦醇不但能提高植物抗病性，还具有抗氧化、保护心血管、抗癌、抗糖尿病、保护神经、抗衰老和抗肥胖等生理及药理作用［12-14］。

关于葡萄梗中绿原酸的含量还未见相关的文献报道。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用［15］。

儿茶素和阿魏酸含量次之，分别为0.53 mg/g～2.95 mg/g和0.87 mg/g～3.27 mg/g，没食子酸和槲皮素的含量较低，分别为0.57 mg/g～1.84 mg/g和0.20 mg/g～1.43 mg/g，鞣花酸的含量最低，甚至在个别样品中未检出。

2.5 不同提取方法对多酚物质提取含量的影响

近年来，国内外对葡萄梗中活性物质提取工艺研究大多集中在有机溶剂提取法，超声波辅助提取法和生物酶法也有少量应用［8］。微波作为一种新型的应用技术近年来广泛应用于植物化学领域，它具有加热速度快、控制方便、受热体系温度均匀、节约能量等优点［16］。由表4可知，微波提取随着时间的增加，提取的多酚物质含量也随之增加，选择微波时间为5 min为最佳提取时间。微波辅助溶剂提取的温度是50℃，过高的温度对多酚物质的提取反而不利。微波提取5 min提取的葡萄梗中多酚物质的含量较高，如绿原酸、槲皮素、没食子酸、白藜芦醇。其中绿原酸和白藜芦醇的含量分别达到13.24 mg/g和6.71 mg/g，该方法可以考虑作为提取葡萄梗的多酚物质主要方法。

超声辅助有机溶剂提取法也是近几年来广泛应用的提取方法，随着提取时间的增加，提取多酚物质的含量也随着增加。超声辅助法提取60 min的多酚物质中，提取的阿魏酸和儿茶素的含量比较高，提取的白藜芦醇含量也比较接近微波法提取的含量。超声提取法也可以考虑作为提取葡萄梗多酚物质的选择方法。

有机溶剂提取法和索氏提取法作为传统的提取方法，提取的多酚物质含量普遍低于上述两种提取方法。

3 结论

采用4种提取方法制备葡萄梗多酚提取液，结果表明，微波辅助提取法制备的多酚提取物中绿原酸、槲皮素、没食子酸和白藜芦醇的含量较高，超声辅助提取法提取物中阿魏酸和儿茶素的含量较高，有机溶剂提取法和索氏提取法提取的多酚物质含量低于上述两种方法。

探讨高效液相色谱技术检测葡萄梗样品中多酚成分组成方法，优化液相色谱条件，选择最佳梯度洗脱条件，用于测定儿茶素、阿魏酸、绿原酸、槲皮素、白藜芦醇、没食子酸和鞣花酸7种多酚的含量。加标回收率和RSD表明该方法具有较好的准确度和精密度。

葡萄梗样品多酚成分分析结果表明绿原酸和白藜芦醇的含量较高，儿茶素和阿魏酸含量次之，槲皮素的含量较低，鞣花酸的含量最低，个别样品中未检出。

多酚物质提取和成分分析研究为葡萄梗废弃物的充分开发和天然资源的深度利用提供了参考依据。

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Extraction and Characterization of Polyphenols in Grape Stems

LI Bo，LI Shuang-shi*，Lan Rong，Wang Xiao-jie，Guo Shan
（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Polyphenols of Grape stems were extracted with the methods of organic solvent extraction，soxhlet extraction，ultrasonic extraction and microwave extraction.After optimizing mobile phase，contents of polyphenols were detected by High Performance Liquid Chromatography（HPLC），equation of linear regression of seven standard material of Polyphenols were determined.The recovery rate was from 94.5%to 98.5%and the relative standard deviation（RSD）was from 1.3%to 2.1%，the method was accurate and sentitive.The contents of chlorogenic acid（5.70 mg/g～13.24 mg/g）and resveratrol（2.22 mg/g～6.71 mg/g）were higher of all the components.The method of microwave extraction for 5 min exhibited better extraction efficiency which would be used for extraction of polyphenols.

grape stems；polyphenols；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.013

2014-07-25

北京市属高等学校人才强教计划资助项目（PXM2014_ 014306_000051）；北京市教育委员会科技计划面上项目专项资助课题（SQKM201210858001）；北京市属高等学校教学名师资助项目（PXM2014_014306_000075）；北京电子科技职业学院院内重点课题（YZKB2013008）

李浡（1973—），女（汉），副教授，博士，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：李双石