冠状动脉内干细胞灌注对载脂蛋白E基冈缺陷小鼠离体心脏血液动力学影响的实验研究

郑秀峰++赵石磊++杨力明

近年来，十细胞移植成为了国内外临床治疗缺血性心脏病的热点研究课题。冠状动脉内十细胞灌注具有操作简单，能在进行冠脉血运重建时实施等优点，受到了相关领域的广泛关注。然而，冠脉内十细胞注射是否会对受体心功能产生影响，以及最后留存于心脏中的细胞数量多少等问题都还未明确。为明确冠状动脉内十细胞灌注对缺血性心脏病心脏血液动力学的影响，该研究在2014年1月-2014年6月间对脂蛋白E（apo E）基因缺陷小鼠进行了实验研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验起止时间：2014年1月-2014年6月。实验动物：20只apoE小鼠、20只WT小鼠，雌雄各半。所有小鼠均经腹腔注射60m/kg苯巴比妥钠，麻醉后将小鼠心脏取出，放人10U/mL的肝素冰水灌注液中，并将主动脉与灌注管相连接。灌注细胞：小鼠胚胎十绌胞，在未分化状态下，进行细胞灌注前2d，开始经贴壁培养，并在灌注当天消化获取。细胞活力经鉴定>99.5%，之后配成l.Oxl0⁶细胞/5mL和2.5xl0⁶细胞/5mL的灌注液。灌注液：NaCl（120mmol/L）+NaHC0₃（25mmol/L）+KCl （4.7mmoI/L）+CaCl₂（2.5mmol/L）+M92S0₄（1.2mmoI/L）+KH₂P0₄（1.2mmol/L）+葡萄糖（15mmol/L）+EDTA（0.5mmol/L）+Pyruvate（2mmol/L）。灌注液酸碱度7.4，温度37℃，同时补充5%的二氧化碳和95%的氧气。

1.2 方法

分别取10只apo E小鼠的心脏作为低剂量组和高剂量组，低剂量组的十细胞灌注量为1.Oxl0⁶细胞，高剂量组的十细胞灌注量为2.5xl0⁶细胞。另外分别取10只WT小鼠的心脏分别作为低剂量对照组和高剂量对照组，低剂量对照组的十细胞灌注量为1.Oxl0⁶细胞，高剂量对照组的十细胞灌注量为2.5xl0⁶细胞。将左心房切开，置入测压球囊达到二尖瓣口水平，并将基础压力调整至10mmHg，然后开始进行绌胞灌注。排除5min内出现冠脉血流大于5mUmin者，收缩压低于100mmHg者，心率低于320次/min及严重心律失常者。

1.3 观察指标

比较离体心脏各时刻（T0：5min稳定后；Tl：灌注完成即刻；T2：灌注后5min；T3：灌注后15min；T4：灌注后30min）的血流动力学指标：LVPP（左心室最大压力）、心率、+dp/dt（左心室等容收缩期压力最大变化速率）、-dp/dt（左心室等容舒张期压力最大变化速率）、LVEDP（左心室舒张末压）。并观察各组的冠脉流量、漏出液中的细胞含量。5min稳定后。

1.4 统计方法

该次研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行处理，计数资料以率%表示，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，数据比较分别采用X2检验和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心率变化

各组的心率变化比较见表1。从表1可知，四组T1～T4时刻的心率均显著低于TO时刻差异有统计学意义（P<0.05）；且高剂量组的心率变化最明显，低剂量组其次，高剂量对照组第三，低剂量对照组的心率变化最小。

2.3 +dp/dt和-dp/dt变化

四组的+dp/dt和-dp/dt变化分别见图2和图3。从图2、3可知，细胞灌注后，四组的+dp/dt和-dp/dt水平均显著降低，且以高剂量组的下降幅度最为明显。

2.4 冠脉流量、漏出液细胞含量

细胞灌注后，四组的冠脉流量均较灌注前显著降低差异有统计学意义（P<0.05）；且以高剂量组的降低幅度最明显，与其他三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。灌注后30min，四组的漏出

3 讨论

目前，初期临床研究和动物实验均证实了细胞替代治疗心血管疾病尤其是缺血性心力衰竭的安全性和可行性。分析近期大量研究报道发现，关于成体十细胞治疗心血管疾病的近30项研究中，仅有4项研究得出的结论有益于该治疗方法，关于移植急性期对心脏血流动力学的影响，以及细胞移植确切疗效等问题的研究仍未得到有效解决。

在该次研究中，针对心血管疾病的冠脉十细胞移植疗法，利用Langendorff体外灌注模型，模拟了冠脉十细胞移植治疗方法，用以观察其对心脏血流动力学指标的影响。该次实验结果显示：四组Tl～T4时刻的心率均显著低于TO时刻差异有统计学意义（P<0.05），且高剂量组的心率变化最明显从TO时刻的（347.6+29.7）次/min降至T4时刻的（245.4+40.9）次/min；并且四组在进行细胞灌注后，LVEDP水平均显著升高，+dp/dt和-dp/dt水平均显著降低，且均以高剂量组的上升或下降幅度最为显著。这提示冠脉十细胞灌注会对LVPP、心率、+dp/dt、-dp/dt、冠脉流量、LVEDP等心脏血流动力学指标产生不利影响，且灌注剂量越高，影响越明显。

apoE缺陷小鼠会因胆固醇代谢障碍而发生高胆固醇血症，同时还会发生全身动脉血管粥样硬化。而临床研究已证实冠心病心肌梗死的基础病因就是冠状动脉粥样硬化，冠心病心肌梗死患者的病理变化与apoE缺陷小鼠冠脉病理变化类似，故该次实验结果能够为临床研究冠脉内十细胞灌注治疗冠心病心肌梗死提供一定的参考、借鉴。一直以来，冠脉细胞移植灌注可能引起冠脉微循环栓塞都是临床应用冠脉内十细胞灌注治疗冠心病的一大顾虑。国外有动物实验研究显示，冠脉抑制白体骨髓MSC（间充质十细胞）会引起冠脉微循环栓塞。在该次研究中，结果也显示十细胞灌注后，冠脉血流量明显降低，尤其是高剂量组小鼠的冠脉血流量降低更为显著。推测这可能是因为冠脉微循环受累所致。十细胞移植的细胞大小、细胞类型都会对冠脉微循环栓塞的形成产生不同的影响。国外有实验研究应用了培养后的字体骨髓MSC，结果发现此类细胞存在较为明显的安全性问题。在该次研究中，应用了胚胎十细胞，该细胞的体积类似于未培养的骨髓单核细胞，虽然尚无文献报道未培养骨髓十细胞会引起微循环栓塞，但不少临床研究都未连续监测细胞移植后的心肌酶谱变化，故冠脉细胞移植是否会对冠脉微循环产生影响仍有待进一步考证。

综上所述，冠脉内十细胞灌注会对载脂蛋白E基因缺陷小鼠离体心脏的血流动力学产生不良影响，并且灌注剂量越大，不良影响越显著。