乳腺癌转移淋巴结T细胞克隆性分析

张建波 吕晓东 楚广民 宋魏 冯稳 刘明阁 于庆凯

(1.郑州大学附属肿瘤医院 病理科 河南 郑州 450003;2.郑州大学附属肿瘤医院 中心实验室 河南 郑州 450003)

T 细胞在机体抗肿瘤免疫应答中起重要作用，它以识别肿瘤相关抗原的T 细胞克隆性增生为特点［1］。研究证明多种实体瘤患者体内存在针对肿瘤抗原特异反应的T 细胞克隆，分析这些克隆性增生的T 细胞，对于了解机体抗肿瘤的免疫状态以及开展特异性免疫治疗有重要意义［2］。本研究旨在利用免疫扫描谱型技术检测乳腺癌转移淋巴结中T 细胞的克隆性增生情况，分析TCR BV 亚家族选择性取用特点，为进一步的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 标本 选取河南省肿瘤医院确诊为乳腺浸润性导管癌(组织学Ⅱ级)住院患者10 例，均为女性，年龄28 ～73 岁，经术中快速冰冻检查明确腋窝前哨淋巴结有癌微转移标本。同时取2 例反应性增生淋巴结标本作为对照。

1.2 主要试剂 Trizol reageant、SuperScript ⅢReverse Transcriptase、LD PCR PrimerⅡA 购自美国Invitrogen公司，Advantage 2 Polymerase Mix 购自美国BD Biosciences Clontech 公司，TaqDNA 聚合酶购自美国Promega公司，胶纯化试剂盒购自美国Omega biotek 公司。

1.3 RNA 提取及cDNA 合成 将癌转移淋巴结周围的淋巴组织及对照组淋巴结标本在200 目筛网上进行研磨后用PBS 进行冲洗，收集细胞悬液并计数，提取总RNA 合成20 μl cDNA。

1.4 PCR 扩增24 个TCR BV 亚家族 根据文献设计并合成24 个TCR BV 亚家族上游引物及共用的FAM 标记下游引物和对照引物［3］，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。总反应体系50 μl，其中cDNA模板1 μl，dNTP 5 μl，10 ×buffer 5 μl，25 mmol/L 氯化镁3 μl，上游引物1.8 μl，共用FAM 标记的下游引物1.8 μl，Taq DNA 聚合酶1.25 U。反应条件为:预变性94 ℃3 min;94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。取PCR 产物7 μl 在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。

1.5 利用GeneScan 技术分析TCR BV 家族的优势取用 取5 μl 荧光引物扩增的TCR BV 各亚家族PCR产物与3μl DNA 变性胶上样缓冲液混合，从中取出2 μl加入0.5 μl 标准品。94 ℃变性4 min 后上样至6%聚丙烯酰胺凝胶，373 DNA 序列分析仪中电泳分析结果，用GeneScan 672 软件基因扫描分析。

2 结果

2.1 T 细胞TCR BV 亚家族RT－PCR 结果 10 例乳腺癌转移淋巴结与反应性增生淋巴结标本中全部24个TCR BV 亚家族均有扩增，扩增片段大小在150 ～350 bp(图1、图2)。由于同一亚家族其上游BV 引物、下游BC 引物在TCRβ 链中的位置是固定的，所以PCR 扩增产物大小取决于多样区基因(BD)以及BV－BD、BD－BJ 基因之间(CDR3)随机插入核苷酸的多少。

图1 对照组1 的24 个TCR BV 亚家族PCR 扩增结果

图2 病例1 的24 个TCR BV 亚家族PCR 扩增结果

图3 对照组1 的24 个TCR BV 亚家族GeneScan 扫描图

2.2 T 细胞中TCR CDR3 GeneScan 分析及TCR BV 亚家族的表达 2 例反应性增淋巴结24 个BV 亚家族均有表达，基因扫描呈多个峰的谱型，即Gaussian分布，提示为多克隆(图3)。10 例乳腺癌患者检测结果显示大部分BV 亚家族呈现与反应性淋巴结相似的多峰图像，少部分家族呈单一主峰，提示PCR产物为CDR3 长度完全相同的T 细胞，也就是单克隆细胞;还有少部分为单一主峰伴个别极低的小峰，提示产物主要来自同一克隆也就是寡克隆性;也有个别为多克隆逐渐向寡克隆形式发展，称为寡克隆增生趋势，各病例24 个BV 亚家族的表达和克隆性结果见表1。图4为病例1 的24 个TCR BV 亚家族CDR3 的基因扫描谱型图，其中BV2 呈单一主峰，BV7、BV23 呈单一主峰和少数小峰图像，即寡克隆，其余BV 亚家族基本为多峰图像。

图4 病例1 的24 个TCR BV 亚家族GeneScan 扫描图

表1 10 例乳腺癌24 个TCR BV 亚家族表达和T 细胞克隆性特点

3 讨论

T 细胞通过TCR 识别抗原，由于TCR 的β 链由V－D－J－C 基因片断重排后编码，可构成具有不同特异性的TCR 分子，由此决定T 细胞识别抗原的多样性和特异性。TCR 重排过程中，V－D－J 的基因片段进行重排和随机插入核甘酸(N 区)形成一高度可变区，称为互补决定区3(CDR3)［4］。通过对CDR3 长度和序列的分析，可作为判别T 细胞克隆性的指标。PCR－GeneScan(基因扫描)－序列分析方法［5］通过检测CDR3 的长度是否相同以确定T 细胞的克隆性，然后对出现单克隆或寡克隆的PCR 产物进行序列分析，从而了解其CDR3 的核甘酸序列，是检测T 细胞克隆性较为理想的方法。

利用该方法，本研究检测了10 位乳腺癌患者转移淋巴结内的T 细胞克隆，结果显示大部分病例均存在T 细胞的克隆性增生，增生形式有单克隆、寡克隆、寡克隆趋势及谱型偏移，说明乳腺癌患者转移淋巴结中存在针对乳腺癌相关抗原的T 细胞克隆性增生。T 细胞在乳腺癌相关抗原的持续刺激下，某一个或者某些与乳腺癌相关抗原有高亲和力的T 细胞克隆得到优势表达并克隆性增生，通过分析这些T 细胞克隆，可以了解机体相应的细胞免疫反应［2］。本研究中1 例患者未发现T 细胞的克隆性表达，只是表现为谱型的偏移，类似的谱型偏移在其他病例也有不同程度的出现，可能与T 细胞对肿瘤相关抗原的反应性克隆性增生处于一个动态反应的过程有关［6］。各患者优势表达的T 细胞克隆亚家族不同，可能与乳腺癌肿瘤抗原的多样性以及个体差异有关。如果对克隆性T 细胞PCR 扩增产物测序，分析其CDR3 氨基酸序列，能进一步了解选择相同BV 亚家族的T 细胞克隆是否来自相同的T 细胞群。

总之，本研究通过分析乳腺癌转移淋巴结T 细胞的克隆性增生情况，为了解机体抗肿瘤免疫应答反应提供了依据，也为寻找肿瘤抗原表位、个体化免疫治疗打下了基础。

［1］He X Y，Yang W M，Tang W T，et al.TRAV gene expression in PBMCs and TILs in patients with breast cancer analyzed by a DNA melting curve (FQ－PCR)technique for TCR α chain CDR3 spectratyping［J］.Neoplasma，2012，59(6):693－699.

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［3］姚新生，马骊，温茜，等.监测TCR CDR3 漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2006，26(6):571－573.

［4］Sainz－Perez A，Lim A，Lemercier B，et al.The T－cell receptor repertoire of tumor－infiltrating regulatory T lymphocytes is skewed toward public sequences［J］.Cancer Res，2012，72(14):3557－3569.

［5］Blohm J H，Blohm N，Hummel M，et al.Detection of clonal T－cell－receptor (TCR)Vbeta rearrangements in explanted dilated cardiomyopathy hearts by semi－nested PCR，GeneScan，and direct sequencing［J］.Med Sci Monit Basic Res，2013，(19):111－117.

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