HIF-1α及ERCC1基因多态性与晚期非小细胞肺癌铂类化疗近期疗效的相关性研究

朱明珍 徐海燕 朱志霞 蒋 华

目前，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占整个肺癌的80% ～85%，是国内发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一［1］，晚期NSCLC的主要治疗手段是化疗，其中铂类(顺铂、卡铂)是必不可少的一线治疗药物。近年来发现缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor 1 alph)在多种恶性肿瘤中均有表达，并与肿瘤的发生、发展、放化疗抵抗及预后等密切相关［2］。近期研究表明，交叉互补基因1(excision repair cross-complementing group 1，ERCC1)表达水平的高低与多种肿瘤的铂类耐药相关，并发现其118位密码子上存在C→T的多态性，此突变最终导致不同基因型的患者呈现铂类化疗疗效的差异［3］。本文通过研究上述2种基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与铂类化疗近期疗效的相关性，旨在探讨指导肺癌患者个体化用药的证据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2012年1月－2014年6月连云港市第二人民医院肿瘤内科收治的晚期NSCLC初治患者68例为研究对象，年龄≤80岁，均为连云港本市人，汉族，将研究对象的性别、年龄、吸烟情况、病理组织学类型及临床分期等基本特征总结成表1所示。

表1 晚期NSCLC患者的临床病理特征

所有患者均经细胞学或组织病理学确诊，有经CT或MRI等扫描可测量的实体病灶。化疗前血常规和肝肾功能在正常范围内，心电图正常，Karnofsky功能状态(karnofsky performance status，KPS)评分均≥70分。化疗前与患者签署知情同意书，并抽取静脉血标本2 ml装入抗凝试管内，提取外周血基因组DNA，－20℃保存备用。

1.2 化疗方案

患者均采用铂类联合方案:铂类药物有顺铂(cisplatin，DDP，25 mg/m2，d 2 ～ 5)、卡铂(Carboplatin，CBP，AUC=5，第2天);其它联合药物可选择吉西他滨(Gemcitabine，Gem，1 000 ～ 1 250 mg/m2，第 1、8 d;)、多西紫杉醇(Docetaxel，DOC，60 ～75 mg/m2，第 1 d，维持 1 h)、培美曲塞(Pemetrexed，500 mg/m2，第 1 d，维持10 min)，接受多西紫杉醇和培美曲塞化疗患者常规服药预处理。上述各方案每3～4周重复1次，2个周期后按实体瘤疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)进行疗效评价。

1.3 疗效评价

按RECIST进行疗效评价:完全缓解(complete response，CR)，所有目标灶消失且至少维持4周;部分缓解(partial response，PR)，肿瘤最大径之和至少缩小30%，并至少维持4周;疾病稳定(stable disease，SD)，病灶缩小未达PR或增加未到PD;疾病进展(progressive disease，PD)，病灶最大径之和增大≥20% 或出现新病灶。参考国内外同类研究，设定(CR+PR)为有效，(SD+PD)为无效。

1.4 聚合酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法

1.4.1 基因组DNA的提取 用无菌抗凝真空管(乙二胺乙酸钠抗凝负压管)收集患者化疗前一天清晨外周静脉血2 ml，2 h内采用DNA试剂盒(购自生工生物工程上海股份有限公司)。按试剂盒上的步骤提取血液基因组DNA，所提取的DNA在紫外分光光度仪上测量OD 260/OD 280值，用以计算DNA纯度与浓度。－20℃冰箱保存备用。

1.4.2 引物的设计与合成 参考 NCBI人类 HIF-1αDNA 序列，应用 Primer Desig ner 3.0.0.1 版软件辅助设计引物HI F-1α C1772T基因序列:rs11549465-F，5 ＇GGACACAGATTTAGACTTGGAGAT 3 ＇;rs11549465-R，5＇GGTGGCATTAGCAGTAGGTTC 3＇;产物大小为187 bp。选择文献提供的 ERCC1基因(codon 118 Asn118Asn)引物序列:rs11615-F，5＇TCCCTATTGATGGCTTCTGC 3＇;rs11615-R，5＇TTCCTGAAGTCTGGGGTGG 3＇;产物大小为175 bp。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.3 PCR反应体系及反应条件 50 μL PCR反应体系(均由生工生物工程股份有限公司提供):模板DNA 1 μL、上下引物各 1 μL、dNTP 10 mM 1 μL、Taq buffer 5 μL、25 mM MgCl25 μL、Taq 酶 5 U/μl 0.5 μL、水35.5 μL。反应在 Gene Amp 2700 PCR仪上进行，PCR反应条件为:95℃预变性3 min;94℃变性30 s，55℃ ～60℃退火35 s，72℃延伸40 s，共35个循环;最后72℃修复延伸5 min。

1.4.4 扩增产物的RFLP分析及鉴定基因型 限制性酶切反应。酶切反应体系 10 μL:去离子水3.5 μL，10 ×Buffer B 1 μL，HphⅠ内切酶 5U，PCR 产物 5 μL。离心机瞬时离心混匀，37.0℃水浴12～16 h。酶切条件及步骤主要参考说明书。鉴定基因型(应用PCR产物纯化回收试剂盒，生工SK1141):分别取5 μL PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳分析，以溴化乙锭(EB)为染色剂，在1%琼脂糖凝胶150 V、100 mA条件下，电泳20 min后，凝胶成像仪下观察带型，分出基因型，加以分析整理。

1.5 统计学方法

应用SPSS 12.0软件进行数据分析，应用Logistic回归模型分析各基因位点多态性与铂类药物疗效的关联性，不同基因型之间化疗疗效的差异采用χ2检验，采用Fisher精确检验进行计算。所有统计学检验均为双侧概率检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118基因型频率

68例晚期NSCLC患者中，HIF-1α C1772T存在3种等位基因型(图1A):C/C型占83.82%(57/68)、C/T型占16.17%(11/68)、T/T型占 0(0/68);ERCC1 codon 118也存在3种基因型(图1B)，分别为:C/C型占 61.76%(42/68)、C/T 型占 32.35%(22/68)、T/T型占5.88%(4/68)。

图1 PCR-RFLP法检测HIF-1α和ERCC1基因型多态位点的琼脂糖凝胶电泳图

2.2 HIF-1α和ERCC1基因的平衡检测

对检测的基因型分布情况应用Hardy-Weinberg定律进行遗传平衡，HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118的位点检测结果显示，P均＞0.05，故该样本来自同一孟德尔群体，达到了遗传平衡，见表2。

2.3 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118 SNP与铂类化疗疗效的相关性

分析患者的性别、年龄、病理组织学类型及临床分期等多项因素对晚期NSCLC患者化疗疗效的影响，结果显示，以上所有因素对晚期NSCLC患者含铂化疗疗效无显著影响(P均＞0.05)。68例患者均完成2个周期化疗，CR 1例，PR 21例，SD 30例，PD 16例，总有效率为32.35%(22/68)。

因两基因携带T/T基因型例数均较少，故将其与C/T合并，均分组为 C/C型和 C/T+T/T型。患者HIF-1α C1772T有效组分别为:C/C型 19/57(33.33%)、C/T+T/T 型 3/11(27.27%)，化疗有效率相比差异无统计学意义(P=0.694)，携带C/C等位基因者对化疗的敏感性是T基因型的1.333倍(95%可信区间为 0.317～5.609);无效组分别为 38/57(66.67%)、8/11(72.73%)。ERCC1codon118有效组分别为:C/C型18/42(42.86%)、C/T+T/T型4/26(15.38%)，化疗有效率相比差异有统计学意义(P=0.019)，携带C/C等位基因者对化疗的敏感性是T基因型的4.125倍(95%可信区间为1.208～14.097);无效组的分别为 24/42(57.14%)、22/26(84.62%)。

表2 影响晚期NSCLC患者化疗疗效的临床因素/例

进一步分析HIF-1α C1772T与ERCC1 codon 118各基因型联合与化疗疗效的关系，分析结果发现同时携带HIF-1α C1772T C/C型及ERCC1 codon 118 C/C基因型患者化疗有效组中有13例，无效组中有9例，有效率为59.09%(13/22)，与其他基因型的联合化疗总有效率［19.57%(9/46)］相比，差异有统计学意义(P=0.001)，见表 3。

表3 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118 SNP与晚期NSCLC含铂化疗近期疗效的关系/例

3 讨论

晚期NSCLC的治疗主要采用铂类联合三代新药作为常用的一线化疔方案。然而，临床研究发现，即使临床分期及一般状况相同、药物使用剂量相同、不同个体对化疗的敏感性仍存在很大差异，且这种差异不能用年龄及用药等因素加以解释，依靠传统经验进行治疗面临极大挑战，因此迫切需要一种或几种能够预测铂类药物化疗疗效的方法，为晚期肺癌的个体化治疗提供依据。

SNPs是指在个体基因组DNA序列中内频率大于1%的单个核苷酸变异，这种变异有时导致其编码的蛋白结构和功能发生改变，从而影响其生物学功能，在肿瘤治疗领域主要表现为不同SNPs基因组患者对治疗发生不同的反应。当前对于DNA修复基因ERCC1的研究较为深入并达成了共识:ERCC1阳性表达可作为铂类耐药的预测因子，但还不足以将其推荐作为临床常规检测，比如ERCC1低表达的患者接受铂类化疗后，仅有1/2左右的患者从中获益，而相当一部分患者无法获益，怎样选择能够更受益的患者进行化疗是近年来研究的重点和热点［4］。

肿瘤的发生、发展与细胞的增殖及凋亡有关，肿瘤的缺氧是实质性肿瘤物理环境的基本特征之一，研究表明肿瘤乏氧不仅与放射治疗抵抗有关，也与药物抵抗、恶性侵袭的生物学行为及不良预后有关。实体瘤中肿瘤细胞缺氧是一种相对普遍的现象［5］，目前已知直接受HIF-1调控的基因有60余种，涉及到血管发生、红细胞生成、能量代谢、细胞增殖和细胞凋亡、肿瘤生长和转移以及肿瘤放化疗抵抗性等多个方面［6］，其中HIF-1α起重要作用，是一个新近较受关注的因子，在大多数人类肿瘤中存在HIF-1α的过表达，现已证实该基因在多种肿瘤细胞系中均有表达，并与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关［2］。关于HIF-1α在患者个体之间是否存在变异，以及其自身的特点是否导致了肿瘤细胞对DNA相关细胞毒性药物敏感性的差异，都值得深入研究。

本研究观察68例晚期NSCLC患者的HIF-1α C1772T位点和ERCC1 codon 118位点SNP与接受铂类药物为主的联合方案疗效的关系，结果发现68例晚期NSCLC患者HIF-1α C1772T位点的3种基因型频率分别为 C/C型占 83.82%(57/68)、C/T型占16.17%(11/68)，无 T/T 型。C/C 基因型 19/57(33.33%)的患者对含铂化疗的近期疗效高于C/T+T/T基因型3/11(27.27%)患者，但无统计学意义(P=0.694)。ERCC1 118位点与铂类药物疗效与国内外研究结果［7］基本相一致:ERCC1 codon 118 C/C基因型18/42(42.86%)的患者对含铂化疗的近期疗效优于C/T+T/T型4/26(15.38%)，差异有统计学意义(P=0.019)。研究并发现同时携带HIF-1α C1772T C/C基因型和ERCC1 118 C/C基因型的化疗疗效与其他组合基因型相比，差异有统计学意义(P=0.001)，值得进一步研究。

本研究显示联合检测HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118多态性对晚期NSCLC铂类近期疗效有一定的预测意义。对于晚期患者来说，组织标本往往很难获得，本实验是从外周血中提取DNA，较为便捷，避免了从许多未接受手术的患者处获取组织的困难，临床具有一定的可行性［8］。下一步我们将全组患者进行随访，并在今后对HIF-1α和ERCC1基因多态性与晚期非小细胞肺癌患者生存的关系方面作出评价，以便更好地指导临床分析与治疗。

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