紫外线诱变选育高产柠檬酸黑曲霉

叶生梅 刘 艳 徐成明 郭兴林

（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000）

紫外线诱变选育高产柠檬酸黑曲霉

叶生梅 刘 艳 徐成明 郭兴林

（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000）

为了选育能利用纤维素产酸的黑曲霉，拓展柠檬酸发酵生产的原料。通过紫外线（UV）诱变选育柠檬酸产量提高的菌株，结果表明，紫外诱变获得了一株遗传性能稳定的优良菌株UV-4，产酸为26.77±0.67g/L，与出发菌株相比产酸增幅达50.39%，且UV-4利用稻草纤维素产酸达10.055±0.42 g/L，较出发菌株提高28.04%。

紫外线诱变；筛选；柠檬酸；黑曲霉

由于人类的生产需要和生活水平的提高，对能源的需求和使用日益增加。地球上的石油、煤、天然气等化石能源被大量开采面临枯竭，且由于化石能源的大量使用带来了大气污染、水污染等，使人类面临能源枯竭和环境污染的严重威胁。寻求可再生的环境友好的新能源是保护我们的地球和可持续发展的迫切要求。我国是农业大国有丰富的可再生的秸秆资源，秸秆资源中丰富的纤维素、半纤维素和木质素等的高值化利用，对解决我国的秸秆焚烧、三农问题和促进农业和环境的可持续发展具有现实意义。

紫外线是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变［1］。我国利用山芋粉、玉米粉等淀粉质原料生产柠檬酸水平处于世界领先，选育了多株高产柠檬酸的黑曲霉菌种［2-4］。而利用纤维素原料生产柠檬酸的菌种选育未见报道［5-6］。本文通过对一株能利用秸秆纤维素产酸的黑曲霉菌株［7］进行诱变选育，以期获得柠檬酸产率和利用稻草秸秆产柠檬酸产率提高的变异株。

1 材料与方法

1.1 实验材料

药品 蔗糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH等均为国药集团化学试剂有限公司产品，分析纯。麦芽汁，自制。

主要仪器设备 QHZ-123B全温振荡培养箱：太仓市华美生化仪器厂；SW-CJ-2FD型双人单面超净工作台：苏州净化设备有限公司；PYXDHS隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；扫描电子显微镜：日本日立S-4800。

黑曲霉S6（Aspergillus niger S6）从堆放中药渣的土壤中分离筛选，本校微生物实验室保存；斜面培养基PDA；诱变后初筛培养基PDA培养基中添加0.02%溴甲酚绿指示剂；诱变后摇瓶复筛和发酵培养基（g/L）（NH4）2SO42.8，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，蔗糖 14.0，pH值6.0，250mL三角瓶分装50mL培养基，121℃灭菌20min。

以预处理稻草［8］为基质的产酸发酵种子培养基/%葡萄糖3，麦芽汁2，（NH4）2SO40.2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05；发酵培养基（g/L）预处理稻草30.0，麦芽汁20.0，葡萄糖20.0，（NH4）2SO42.8，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5；pH值 6.0，250mL三角瓶分装50mL，115℃灭菌30min。

1.2 实验方法

1.2.1 黑曲霉孢子悬液的制备

用无菌生理盐水将活化的斜面菌种孢子刮下，转入带玻璃珠的三角瓶并振荡，再用四层擦镜纸过滤得单孢子悬液，调整孢子数约106-107个/mL。

1.2.2 紫外线诱变及突变株筛选 参照［1］方法

取3mL孢子悬液于平皿中，打开皿盖，在距离30cm，功率15W的紫外灯下照射2、4、6、8、10min。以诱变前的孢子悬液为对照，每种诱变处理及对照均按10倍稀释法稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂布于筛选平板，35℃培养三天，计算菌落数及致死率。用接种环从筛选平板中挑起变色圈直径（T）与菌落直径的比值（R）较大的黑曲霉菌株接种于斜面培养基，35℃培养4-6d后用无菌水冲洗斜面孢子并过滤制成单孢子悬液，用于复筛及产酸发酵。

1.2.3 种子培养及发酵 参照［7］方法进行。

摇瓶复筛及柠檬酸发酵：直接用诱变筛选的黑曲霉孢子悬液接种，1mL/瓶，35℃，250r/min，培养4d。每个发酵三重复。

工程测量过程中的一系列测绘工作需进一步改进，应不仅对大范围的工程项目进行监测，还应适当缩小监测的范围来使用无人机技术测绘，对工程项目进行更为精准和全面的监测。在遥感监测的过程中，应确保无人机测绘技术能对大范围的项目，检测的范围可以扩大，并保证应用的稳定性及可控性，能够对监测范围、监测尺度进行调节控制，项目监测的区域可用三维模式来展现。对于较恶劣、复杂的环境，比如高山、丛林等，使用无人机测绘技术还可以进行低空航拍，测量及拍摄更为灵活，用途更为广泛。

1.3 分析测试方法

总酸的测定—NaOH滴定法［2］：发酵液经滤纸过滤后，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，记录所消耗的氢氧化钠溶液的体积V，计算产酸量A。

A=C×V×M×1000/3×1000式中A为产酸量，g/L；C为氢氧化钠溶液浓度，mol/L；M为柠檬酸的摩尔质量，g/mol；V为消耗的氢氧化钠溶液的体积，mL。

pH的测定：精密pH试纸。

发酵前后稻草纤维结构的变化 扫描电子显微镜（SEM）观察。

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变致死率

图1 紫外线照射时间对致死率的影响

2.2 突变菌株的筛选结果

选取5min为紫外线诱变照射时间，通过初筛从筛选平板中挑取变色圈直径（T）与菌落直径（G）的比值（R）较大的黑曲霉菌株10株接种斜面，35℃培养 4d后和用无菌水制备孢子悬液用于摇瓶复筛，筛选结果见表1。从表1可见诱变筛选到的10菌株产酸量与出发菌S6相比得到不同程度提高。其中产酸最高的是UV-4号菌株为26.90±0.87g/L，产酸较出发菌株S提高51.1%。这说明经过UV明显提高了黑曲霉菌株的产酸能力。

表1 突变菌株初筛、复筛结果

2.3 突变菌株产酸稳定性

选取产酸提高最大及产酸增幅最大的突变株uv-4，进一步传代培养，连续传代5次，对其遗传稳定性进行检验，实验结果见表2。

表2 突变株UV-4的产酸稳定性实验结果

由表2可看出，突变株UV-4产酸在传代过程中产酸性能稳定，平均产酸26.77±0.67g/L。UV-4是一株产酸性能稳定的黑曲霉变异菌株。可作为利用研究纤维素产酸的实验菌种，以期拓展柠檬酸生产的原料，在农作物秸秆高值化利用方面进行有益探索。

2.4 UV-4利用纤维素原料产酸考察

2.4.1 突变前后利用纤维素产酸比较

以预处理稻草为基质产酸发酵，每隔12h取样，发酵液过滤，滤液测定酸度，实验结果如图2所示。从图2可看出，菌株UV-4和S6均能利用的其纤维素酶系和产酸酶系分解纤维素原料产酸，但UV-4利用预处理稻草发酵产酸量高于S6，到72h时UV-4产酸量10.05±0.42 g/L，比S6提高了28%。可见UV诱变提高了菌株利用纤维素原料的性能，UV-4是一株利用纤维素原料产酸的目的菌株，有一定的研究和利用的价值。

2.4.2 UV-4利用预处理稻草粉产酸发酵前后稻草纤维显微结构比较

UV-4菌株发酵预处理稻草产酸84h后，发酵液过滤，滤渣用蒸馏水洗至中性，60℃烘干备用。精确称取一定量的滤渣、未处理稻草粉、预处理稻草粉，分别加入一定量的中性洗涤剂放入已沸的高压蒸汽灭菌锅中，100℃保温1h，取出用沙芯漏斗过滤，残渣用蒸馏水洗、丙酮洗涤。置于60℃干燥，干燥后的纤维用扫描电镜观察其形态结构。电镜观察图如图3所示。

图2 诱变前后菌株发酵稻草产酸比较

图3 稻草秸秆SEM显微结构比较

从SEM图可见，预处理后稻草秸秆表面比未处理的光滑，纤维暴露，颜色变浅，这是由于预处理使秸秆中的大部分木质素溶出的缘故。从图c，f看出，预处理稻草经黑曲霉发酵后，残存的稻草纤维截面平整，表面更光滑及纤维崩解现象。通过显微观察进一步说明在发酵过程中黑曲霉利用了秸秆纤维素。

3 小结

紫外线诱变操作简单、有效是广泛采用的物理诱变手段。本文利用UV诱变选育到黑曲霉利用预处理稻草发酵产酸提高的目的菌株UV-4。UV-4利用稻草纤维素产酸达10.05±0.42 g/L，较出发菌株提高28%。

［1］沈萍，陈向东.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，2007：126-129.

［2］任晓莉，赵林，杨宝强，等.UV和NTG复合诱变柠檬酸生产菌种黑曲霉［J］.天津大学学报，2010，（6）：53-56.

［3］王庆昭，李剑，刘伟，等.高产柠檬酸的SHAM特性黑曲霉突变株的选育［J］.食品与发酵工业，2010，（4）：25-29.

［4］常春，王娟，马晓建，等.利用玉米粉产柠檬酸黑曲霉的筛选［J］.郑州轻工业学院学报（自然科学版），2005，（1）：47-49.

［5］黄健，张迎君，武峥，等.柑橘皮渣发酵生产柠檬酸工艺参数优化研究［J］.西南师范大学学报（自然科学版），2007，（3）：106-110.

［6］杨保伟，盛敏，来航线，等.苹果渣基质柠檬酸高产菌株选育［J］.微生物学杂志，2008，（6）：24-29.

［7］叶生梅，丁叶强，张国庆.利用纤维素原料生产柠檬酸菌株的筛选［J］.食品工业科技，2014，（20）：217-220.

［8］叶生梅，许盼吉，汪江林.稻草秸秆的预处理及发酵乙醇的实验研究［J］.中国粮油学报，2009，（6）：133-136.

ON MUTATION AND BREEDING OF Aspergillus niger OF PRODUCTIVE CITRIC ACID FERMENTATION THROUGH ULTRAVIOLET RAYS

YE Sheng-mei LIU Yan XU Cheng-ming GUO Xing-lin
（School of Biological&Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu Anhui 241000）

This paper is designed to breed the Aspergillus niger through adopting cellulose to produce acid and to enrich the raw materials of citric acid fermentation.Breeding of Aspergillus niger for citric acid fermentation through ultraviolet rays has been studied in this paper.A good niger UV-4 has been obtained through ultraviolet rays，which has genetic stability.The citric acid yield is 26.77±0.67g/L and is 50.39%higher than that of the original niger.UV-4 can produce 10.05±0.42g/L of the citric acid through using straw cellulose by，and it is 28.04%higher than that of the original niger.

ultraviolet mutation；screening；citric acid；Aspergillus niger

陈小举

TQ920

A

1672-2868（2015）03-0054-05

2015-01-10

安徽省教育厅自然科学研究项目（项目编号：KJ2010A349）；安徽省高校省级优秀青年人才项目（项目编号：2012SQRL087）

叶生梅（1963-），女，安徽太湖人。安徽工程大学，高级实验师，硕士。研究方向：微生物菌种选育研究。

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