反相高效液相色谱法测定石榴皮多酚类物质方法的建立及分析

蒲 博，张驰翔，王 周，唐鹏程，焦士蓉

（西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039）

反相高效液相色谱法测定石榴皮多酚类物质方法的建立及分析

蒲 博，张驰翔，王 周，唐鹏程，焦士蓉

（西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039）

建立了同时测定石榴皮多酚中绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素含量的反相高效液相色谱方法。采用色谱柱Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm），其流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（体积比17∶83），流速为1.0mL/min，检测波长310nm，柱温为30℃。建立安石榴甙测量方法，色谱柱为Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-2%冰醋酸（体积比7∶93）；体积流量为1.0mL/min；检测波长为232nm；柱温25℃。结果表明：绿原酸、表儿茶素、鞣花酸、槲皮素和安石榴甙在一定浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，其平均回收率分别为100.66%（RSD=2.06%）、100.05%（RSD=0.58%）、100.05%（RSD=0.51%）、99.51%（RSD=1.22%）和99.79%（RSD=0.52%）。此结果说明反相高效液相色谱可用于测定石榴皮多酚类物质。

石榴皮多酚；色谱柱；RP-HPLC

石榴皮为石榴干燥果皮，其性酸、味涩。石榴皮中含有绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素及安石榴甙等多酚类化合物，具有抗癌、抗氧化等生物活性［1-4］。对于石榴皮成分的高效液相测定法，大多都是针对其鞣花酸含量的测定，另外对其儿茶素和表儿茶素的测定也较多，对于石榴皮中安石榴甙、槲皮素、绿原酸测定的文献较少［5-11］。

本实验中，笔者建立同时测定石榴皮多酚中绿原酸、表儿茶素、鞣花酸、槲皮素的反相高效液相色谱方法（RP-HPLC），并建立安石榴甙的 RPHPLC的测定方法和参数，以期为石榴皮药材的质量评价、控制及其规范化种植研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴皮，成都中药饮品有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯），Fisher公司；鞣花酸、槲皮素、绿原酸、表儿茶素、安石榴甙，Sigma公司。

LC20高效液相色谱系统、配SPD-M20A型二级管阵列检测器、CTO-20A型柱温箱和SIL-20AC型自动进样器，岛津（SHIMADZU）公司；水相、有机相0.45μm微孔滤膜、0.45μm微孔滤头，天津津腾实验设备有限公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 波长的选择

通过全波谱扫描，对绿原酸、表儿茶素、鞣花酸、槲皮素和安石榴甙的检测波长进行选择［12-13］。

1.2.2 色谱条件

绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素混标色谱条件［14-15］：色谱柱为 Hypersil ODS2（250nm×4.6nm，5μm，大连依利特公司）；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（体积比17∶83）；流速为1.0mL/min；检测波长310nm；柱温为30℃；理论塔板数按鞣花酸计大于8 000；鞣花酸（保留时间为8.681min）、槲皮素（保留时间为17.238min）、绿原酸（保留时间为4.392min）、表儿茶素（保留时间为5.463min）的分离度大于1.5。

安石榴甙色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm，大连依利特公司）；流动相为甲醇-2%冰醋酸溶液（体积比7∶93）；体积流量为1.0mL/min；检测波长为232nm；柱温25℃；理论塔板数按安石榴甙计大于8 000；分离度大于1.5。

1.2.3 对照品溶液的准备

精密称取干燥至恒质量的对照品鞣花酸5mg、槲皮素5mg、绿原酸2mg、表儿茶素5mg和安石榴甙5mg，用50%（体积分数）的甲醇溶解至50mL，将配好的溶液超声脱气20min，冷却至室温，摇匀，过滤，滤液即为标准品溶液，待用。

1.2.4 供试品溶液的制备

石榴皮经干燥、粉碎过180μm筛，以多酚为考察指标提取条件：温度75℃、料液比1∶30g/mL、提取时间140 s，经水提取得到的提取物多酚质量分数为22.06%，浓缩、冻干，精密称取冻干粉500mg，用50%的甲醇定容至50mL，用于绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素的测量。称取冻干粉50mg，用50%的甲醇定容至50mL，用于安石榴甙的测量。将配好的溶液都超声脱气20min，将其冷却至室温，振荡摇匀，过滤，滤液即为供试品溶液，待用。

1.2.5 纯化品试样的制备

将石榴皮提取物经D101型大孔树脂纯化，浓缩、冻干，得到石榴皮纯化物。用福林酚比色法测得其中多酚含量为71.63%。按照方法1.2.3制备纯化品溶液，待用。

2 结果与讨论

2.1 波长的选择

通过全波谱扫描发现，在310nm波长下，绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素均有较强吸收峰，且无干扰物质出现，因此选用在310nm波长下检测绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素。而安石榴甙在232nm波长下有最大吸收度，故选用232nm作为安石榴甙的检测波长。

2.2 色谱分析结果

绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素的对照品及样品色谱图见图1。

安石榴甙的对照品及样品色谱图见图2。

2.3 线性关系考察

取鞣花酸、槲皮素、表儿茶素和安石榴甙对照品4个梯度溶液25、50、75和100 μg/mL；取绿原酸对照品4个梯度溶液10、20、30和40 μg/mL。在上述色谱条件下分别对每个标准品的每个浓度进样20 μL，测定其峰面积。以进样浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到各自的回归方程。鞣花酸：Y=1.5×106X-5.3×105（R2= 0.999 4）；绿原酸：Y=7.4×107X-1.2×105（R2= 0.999 3）；槲皮素 Y=1.6×108X-7.5×105（R2= 0.999 4）；表儿茶素Y=2.1×105X-6.9×104（R2= 0.999 5）；安石榴甙Y=3.9×105X-2.9×105，（R2= 0.999 5）。

图1 绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素的标准品与供试品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of chlorogenic acid，epicatechin，ellagic acid and quercetin in standard solution and sample solution

图2 安石榴甙的标准品与供试品HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of pomegranate glycoside in standard solution and sample solution

2.4 精密度试验

精密吸取绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素混合对照品溶液20 μL以及安石榴甙对照品20 μL，重复进样5次，测定其峰面积。它们峰面积相对标准偏差（RSD）值分别为 0.68%、0.72%、0.38%、0.80%和1.50%（n均为5）。结果表明仪器精密度较好。

2.5 稳定性试验

分别将绿原酸、表儿茶素、鞣花酸、槲皮素混合供试液和安石榴甙供试液于0、2、6、8和10 h各进样20 μL，测定其峰面积，它们峰面积RSD值分别为1.12%、0.75%、0.20%、0.74%和 0.49%（n均为5）。结果表明供试液在常温下10 h内较稳定。

2.6 重现性试验

按照供试溶液制备的方法，对同一批样品，分别取样平行测定5次，进样20 μL，测定其峰面积。它们峰面积RSD值分别为1.14%、1.90%、0.35%、1.04%和1.01%（n均为5）。该方法重现性良好。

2.7 加样回收试验

精密称取已测含量未纯化（绿原酸0.41%、表儿茶素0.30%、鞣花酸6.23%、槲皮素0.61%和安石榴甙28.73%）的石榴皮提取物冻干粉若干，加入适当的对照品，按上述方法制备5份样品溶液，进样20 μL，分别进行回收率测定（n=5），结果见表4。

表4 回收率试验结果Table 4 recovery test results

2.8 石榴皮纯化品中多酚物质的含量测定

采取上面绿原酸、表儿茶素、鞣花酸和槲皮素混标及安石榴甙单标的色谱方法对石榴皮纯化品中多酚物质的含量进行测定，进样量为20 μL，结果见表5。由表5可知，纯化后石榴皮提取物中多酚物质的含量都得到了提高。

表5 纯化前与纯化后多酚物质含量Table 5 content before purification and purified polyphenols

3 结论

通过实验得到石榴皮提取液冻干粉的鞣花酸含量为6.23%；槲皮素的含量为0.61%；绿原酸的含量为0.41%；表儿茶素含量为0.30%；安石榴甙含量为28.73%。通过精密性、稳定性、重现性试验等，表明按本实验方法检测石榴皮中绿原酸、表儿茶素、鞣花酸、槲皮素和安石榴甙比较简便和可靠。最后对石榴皮提取物纯化品中多酚物质进行了RP-HPLC法测量，测得结果为鞣花酸含量9.44%，绿原酸含量0.53%，槲皮素含量0.75%，表儿茶素含量0.32%，安石榴甙含量46.91%。

［1］高翔.石榴的营养保健功能及其食品加工技术［J］.中国食物与营养，2005（7）：40-42.

［2］李海霞，王钊，刘延泽.石榴科植物化学成分及药理活性研究进展［J］.中草药，2002，33（8）：765-766.

［3］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：精华本［M］.上海：上海科学技术出版社，1998.

［4］林佳，李琰.石榴叶的化学成分研究［J］.中南药学，2005（2）：25-27.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典：第一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：63.

［6］Negi P S，Jayaprakasha G K，Jena B S.Antioxidant and antimutagenic activities of pomegranate peel extracts［J］.Food Chem，2003，80：393-397.

［7］Ephraim P，Lansky，Robert A.et al.Punica granatum（pomegranate）and its potential for prevention and treatment of inflammation and cancer［J］.Ethnopharmacol，2007，109：177-206.

［8］Hamendra Singh Parmar，Anand Kar.Protective role ofCitrus sinensis，Musa paradisiaca，and Punica granatum peels against diet-induced atherosclerosis and thyroid dysfunctions in rats［J］. Nutrit Res，2007，27（11）：710-718.

［9］Eduardo Osorio，Mariano Flores，DanielHernández，etal. Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya Illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum）and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.）against plant pathogenic fungi［J］.Ind Crops Prod，2010，31（1）：153-157.

［10］刘振平，陈祥贵，彭海燕，等.RP-HPLC法同时测定石榴皮中4种多酚类成分的含量［J］.中国药房，2013（3）：238-240.

［11］李梦颖，李建科，于振，等.石榴多酚的提取、检测和成分分析研究进展［J］.食品工业科技，2013（17）：384-388.

［12］李海霞，张红玲，刘延泽，等.RP-HPLC法测定石榴皮中安石榴苷［J］.中草药，2006，37（5）：780.

［13］Zhou Honghao，Lv Jiao，Yuan Qipeng.Preparative isola-tion and purification of punicalin from pomegranate husk by high-speed countercurrent chromatography［J］.Sep Purif Technol，2010，72：228.

［14］刘振平，陈祥贵，杨潇，等.RP-HPLC同时测定石榴皮提取物中的3种鞣质成分［J］.中国中药杂志，2011，36（19）：2645-2647.

［15］刘振平，陈祥贵，彭海燕，等.RP-HPLC法测定石榴汁中的4种多酚类成分［J］.中国食品学报，2013（1）：183-187.

（责任编辑 荀志金）

Determination of polyphenols in pomegranate peel by reverse-phase HPLC

PU Bo，ZHANG Chixiang，WANG Zhou，TANG Pengcheng，JIAO Shirong
（School of Food and Science and Biotechnology，Xihua University，Chengdu 610039，China）

We established reverse-phase HPLC to separate and determine the contents of chlorogenic acid，epicatechin，ellagic acid and quercetin in pomegranate peel polyphenol.The chromatographic conditions were as follows：Hyspersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）at 30℃ with UV detector at 310nm，mobile phase of acetonitrile-0.4% phosphoric acid（17∶83），and flow rate 1.0mL/min. Simultaneously，We established a method to measure the content of pomegranate glycosides.The chromatographic conditions were as follows：Hyspersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）at 25℃ with UV detector at 232nm，mobile phase of methanol-0.4%glacial acetic acid（7∶93），and flow rate 1.0mL/min.Chlorofenic acid，epicatechin，ellagic acid，quercetin and pomegranate glycosides showed a good linear relationship with peak area in an appropriate concentration range，and the average recoveries were 100.66%（RSD=2.06%），100.05%（RSD=0.58%），100.05%（RSD=0.51%），99.51%（RSD= 1.22%）and 99.79%（RSD=0.52%），respectively.Our findings prove that the reverse-phase HPLC developed is suitable to determine polyphenols from pomegrunate.

pomegranate peel polyphenols；chromatographic column；RP-HPLC

O657.72

A

1672-3678（2015）03-0055-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.010

2014-04-16

教育部春晖计划（12205543）；四川省教育厅自然科学重点项目（09ZA158）；西华大学省级重点实验室开放研究基金

蒲 博（1989—），男，四川巴中人，硕士研究生，研究方向：食品科学；焦士蓉（联系人），教授，E-mail：jsrong2004@163.com