绿原酸抗人皮肤成纤维细胞衰老的研究

陈婷 江智茂 于波 马刚

绿原酸抗人皮肤成纤维细胞衰老的研究

陈婷 江智茂 于波 马刚

目的探讨绿原酸在乙二醛诱导的人皮肤成纤维细胞衰老中的保护作用。方法使用1 mmol/L乙二醛处理体外培养的人皮肤成纤维细胞，构建细胞衰老模型。用5、10、20、40、80 μmol/L绿原酸和乙二醛共同处理人皮肤成纤维细胞，MTT法检测细胞增殖活性，筛选出绿原酸的有效浓度。1 mmol/L乙二醛分别与有效浓度的绿原酸（10、20、40 μmol/L）共同作用于成纤维细胞，细胞衰老β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法及实时荧光定量PCR法检测衰老细胞比例和衰老基因p16INK4a mRNA的表达情况。统计分析采用单因素方差分析和LSD法。结果与空白对照组人皮肤成纤维细胞增殖（100%±6.90%）相比，乙二醛可明显抑制细胞增殖（55.65%±2.00%），两组差异有统计学意义（P＜0.01）。与乙二醛组细胞增殖相比，除乙二醛+5 μmol/L绿原酸组（55.36%±2.58%）外，乙二醛+10、20、40、80 μmol/L绿原酸组对细胞增殖均有不同程度地保护作用（细胞增殖率分别为60.75%±1.32%、67.65%±1.90%、75.71%±3.25%、75.69%±2.38%），呈剂量依赖性，40 μmol/L绿原酸达高峰，80 μmol/L绿原酸与40 μmol/L组相比，细胞活力的差异无统计学意义（P＞0.05），因此筛选出绿原酸的有效浓度为10～40 μmol/L。与空白对照组衰老细胞比例（13.00%±2.22%）比较，加入乙二醛后，衰老细胞明显增多（35.65%±2.24%），差异有统计学意义（P＜0.01）。与乙二醛组细胞SA-β-gal染色阳性率相比，分别加入10、20、40 μmol/L绿原酸与乙二醛共培养后，细胞SA-β-gal染色阳性率呈剂量依赖性减少（31.50%±2.13%、22.31%±3.11%、19.32%±3.01%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组衰老基因p16INK4a mRNA的表达比较，乙二醛组明显增高（2-ΔΔCt：1.00 ± 0.06 比 0.26 ± 0.05，P＜ 0.01），分别加入 10、20、40 μmol/L 绿原酸与乙二醛共培养后表达下降（0.88±0.08、0.73±0.06、0.68±0.04，P＜0.05）。结论绿原酸在乙二醛致人皮肤成纤维细胞衰老中具有潜在的保护作用。

皮肤衰老；成纤维细胞；乙二醛；绿原酸；细胞衰老；细胞增殖；p16INK4a mRNA

皮肤衰老的本质是皮肤细胞的衰老。细胞衰老是指随着细胞增殖代数的增多，细胞进入一个不可逆的生长停滞状态［1］。体外实验中，利用紫外线、乙二醛、H2O2等应激处理可以刺激细胞提前衰老，被称为应激诱导的提前衰老［2］。具有多种药理学作用的绿原酸是否也有延缓皮肤衰老的功能尚不清楚。本实验利用1 mmol/L乙二醛作用于成纤维细胞，建立细胞衰老模型，通过检测细胞衰老指标如增殖能力、细胞衰老β半乳糖苷酶（senescence associatiated-β-galactosidase，SA-β-gal）、衰老基因p16INK4a mRNA的水平，观察绿原酸对乙二醛诱导的成纤维细胞衰老模型的保护作用。

材料和方法

一、试剂与仪器

高糖DMEM培养液（美国HyClone公司），噻唑蓝（MTT）粉剂（美国Gibco公司），鼠抗人波形蛋白抗体、兔抗第8因子抗体、鼠抗角蛋白19抗体（福州迈新生物技术开发有限公司），TRIzol溶液（美国Invitrogen公司），SA-β-gal染色试剂盒（美国Millipore公司），引物［英潍捷基（上海）贸易有限公司］，绿原酸（美国Sigma公司），乙二醛［梯希爱（上海）化成工业发展有限公司］；倒置荧光显微镜、Leica DM4000M正置显微镜（德国Leica公司）。

二、体外培养人皮肤成纤维细胞及实验分组

选取在北京大学深圳医院泌尿外科行包皮环切术切除的儿童包皮组织进行皮肤成纤维细胞原代培养，采用酶消化法分离包皮组织，将分离所得的细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。免疫组化法测定波形蛋白、第8因子相关抗原和细胞角蛋白19在细胞的表达情况，鉴定完毕后取生长状况良好的3～8代成纤维细胞进行试验。实验分为：①空白对照组：单纯用细胞培养液培养3 d，不加任何物质干预；②乙二醛损伤组：在细胞培养系中加终浓度为1 mmol/L乙二醛培养3 d，建立细胞衰老模型；③绿原酸保护组：在细胞培养系中分别加入终浓度为1 mmol/L乙二醛及5、10、20、40、80 μmol/L绿原酸共培养3 d。

三、MTT法检测细胞增殖

按6 000个/孔将细胞接种在96孔板上，24 h后，按实验分组加入药物培养，3 d后加入MTT试剂，孵育4 h，弃去培养液，二甲基亚砜（DMSO）充分溶解后在酶标仪490 nm下测定A值。每组设5个复孔，重复3次实验。相对细胞活力=处理组A值/空白对照组A值×100%。

四、SA-β-gal染色法检测细胞衰老程度

当细胞融合达80%以上时，胰酶消化细胞，细胞爬片。按实验分组加入药物培养，3 d后按说明书进行SA-β-gal染色，胞质被蓝染的细胞为衰老细胞，在正置显微镜BF模式下拍照（×200）。SA-βgal阳性率=连续4个视野的蓝染细胞数/连续4个视野下细胞总数×100%。

五、qRT-PCR检测p16INK4a mRNA表达

按1×105个/孔将细胞接种于6孔培养板中，培养24 h后，按实验分组加入药物，3 d后采用Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测A260与A280，计算RNA浓度与纯度，保存剩余RNA于-80℃冰箱中。按反转录试剂盒将提取的RNA转录成cDNA。实时荧光定量 RT-PCR：总反应体系（20 μl）包括反转录产物 cDNA 1.0 μl、荧光染料 SYBR Greenq PCR 10 μl、染料 Rox Reference Dye 和上下游引物分别 0.4 μl、dH2O 7.8 μl。将配制完成的反应液离心混匀，放入PCR扩增仪。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，1个循环；然后57℃退火，延伸1 min，40个循环。以GAPDH为内参照基因，分析结果则使用国际通用的2-ΔΔCt法。引物序列：p16INK4a上游引物 5′-GAAGGTCCCTCAGACATCC CC-3′，下游引物 5′-CCCTGTAGGACCTTCGGTGA C-3′；GAPDH 上游引物 5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′，下游引物 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′。

六、统计学分析

结 果

一、人皮肤成纤维细胞的体外培养及鉴定

镜下见人皮肤成纤维细胞状态良好，形态呈梭形，胞核为卵圆形。免疫组化结果显示，细胞表达波形蛋白，第8因子相关抗原和细胞角蛋白19均未见表达。细胞形态及免疫组化的结果均显示培养的细胞是成纤维细胞。

二、绿原酸及乙二醛对人皮肤成纤维细胞增殖能力的影响

如表1所示，各实验组人皮肤成纤维细胞增殖能力差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组相比，乙二醛可明显抑制细胞增殖，差异有统计学意义（P＜0.01）。与乙二醛组相比，加入5 μmol/L绿原酸对乙二醛抑制成纤维细胞的增殖没有明显影响；从10 μmol/L开始，绿原酸对乙二醛抑制的细胞增殖有保护作用，呈剂量依赖性，到浓度为40 μmol/L达高峰，差异均统计学意义（P＜0.05）。而80 μmol/L绿原酸与40 μmol/L绿原酸相比，细胞活力的差异无统计学意义（P＞0.05）。根据以上实验结果，我们选用10～40 μmol/L范围的绿原酸用于后续实验。

三、绿原酸和乙二醛对皮肤成纤维细胞SA-βgal表达的影响

见表1，图1。各实验组人皮肤成纤维细胞SA-β-gal表达差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组比较，加入乙二醛后，细胞数量减少，衰老细胞明显增多，衰老阳性率也明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。分别加入10、20、40 μmol/L 绿原酸与乙二醛共培养后，乙二醛诱导的人皮肤成纤维细胞衰老有不同程度的抑制，与乙二醛组相比，10～40 μmol/L绿原酸+乙二醛组细胞SA-β-gal染色阳性率呈剂量依赖性减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中，以40 μmol/L绿原酸保护作用最为明显。

表1 绿原酸及乙二醛对人皮肤成纤维细胞增殖能力、细胞衰老β 半乳糖苷酶（SA-β-gal）、p16INK4a mRNA 表达的影响（±s）

表1 绿原酸及乙二醛对人皮肤成纤维细胞增殖能力、细胞衰老β 半乳糖苷酶（SA-β-gal）、p16INK4a mRNA 表达的影响（±s）

注：n=3。a：与空白对照组相比，P ＜ 0.01；b：与乙二醛组相比，P ＜ 0.05；c：与乙二醛组相比，P ＜ 0.01；d：与空白对照组相比，P ＜ 0.05

组别 相对细胞活力（%）p16INK4a mRNA（2-ΔΔCt）空白对照组 100.00±6.90 13.00±2.22 0.26±0.05乙二醛组 55.65±2.00a 35.65±2.24a 1.00±0.06a乙二醛+5 μmol/L绿原酸组 55.36±2.58a - -乙二醛+10 μmol/L绿原酸组 60.75±1.32ab 31.50±2.13ab 0.88±0.08ab乙二醛+20 μmol/L绿原酸组 67.65±1.90ac 22.31±3.11ac 0.73±0.06ab乙二醛+40 μmol/L绿原酸组 75.71±3.25ac 19.32±3.01dc 0.68±0.04ab乙二醛+80 μmol/L绿原酸组 75.69±2.38ac - -F值 70.06 40.62 77.22 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 SA-β-gal阳性率（%）

图1 绿原酸和乙二醛对皮肤成纤维细胞SA-β-gal表达的影响（×200） 1A：空白对照组；1B：乙二醛组，蓝染细胞增多，细胞总数减少；1C～1E：分别为10、20、40 μmol/L绿原酸和乙二醛共培养组，与乙二醛组相比，蓝染细胞数逐渐减少，而细胞总数逐渐增多

四、绿原酸和乙二醛对皮肤成纤维细胞p16INK4a mRNA表达的影响

见表1。qRT-PCR法检测各组p16INK4a mRNA表达结果显示，各组差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组比较，乙二醛可明显增高衰老基因p16INK4a mRNA的表达（P＜0.01）。分别加入10、20、40 μmol/L 绿原酸与乙二醛共培养后，p16INK4a mRNA的表达下降（均P＜ 0.05），但 10、20、40μmol/L 组间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

采用应激诱导细胞提前衰老是目前研究细胞衰老及抗衰老药物的常用方法。Sejersen 和 Rattan［2］发现，1 mmol/L乙二醛作用于皮肤成纤维细胞3 d，细胞增殖活性明显下降，SA-β-gal表达量明显上升，晚期糖基化终末产物（AGEs）合成增多，从而建立细胞衰老模型。这种方法不仅可以诱导成纤维细胞发生衰老改变，而且在皮肤角质形成细胞中也有同样的发现［3］。目前利用乙二醛诱导的细胞衰老模型在抗皮肤衰老药物的研究中得到广泛应用［4］。其机制可能与乙二醛活跃的性质有关，其α醛基与蛋白质有高反应性，可与精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸发生反应生成AGE，而AGE的不断累积是导致皮肤发生衰老的重要机制之一［5-7］。

目前尚无一种特异性的标志物界定细胞处于衰老状态，需从多角度综合分析［8］。MTT实验通过存活细胞数间接揭示细胞增殖能力。SA-β-gal染色实验是判断细胞衰老的重要方法，其原理可能与衰老细胞中溶酶体β-半乳糖苷酶表达增多有关［9］。p16INK4a是一种细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂基因，在调控细胞衰老过程中扮演关键作用。p16INK4a在皮肤中的含量与年龄有显著的线性关系，其在衰老皮肤的含量是年轻皮肤的7倍［10］，因此p16INK4a也被称为衰老基因。本实验选用以上3种方法综合判断细胞是否处于衰老状态。在本实验中，加入乙二醛后，细胞的增殖活性明显下降，SA-β-gal表达增多，p16INK4a mRNA表达量上升，表明乙二醛可诱导细胞衰老。

绿原酸在咖啡、水蜜桃、绿茶等食物中含量丰富，也是杜仲和金银花的有效活性成分。但目前尚未能对绿原酸进行化学合成。国内外学者发现，绿原酸有许多生物活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、降血压等［11-12］。Kim 等［13］在体外实验中发现，绿原酸可抑制AGE合成，阻碍胶原蛋白与AGE之间交联形成。本研究MTT实验显示，与乙二醛组相比，10～40 μmol/L绿原酸对细胞增殖的保护作用呈剂量依赖性，而浓度为5 μmol/L时没有明显效果，浓度为80 μmol/L与40 μmol/L之间差异无统计学意义。据此，我们选用10、20、40 μmol/L为后续实验浓度。10～40 μmol/L绿原酸与乙二醛共孵育成纤维细胞后，细胞SA-β-gal阳性率均明显低于乙二醛组，但仍高于空白对照组。p16INK4a mRNA表达情况与MTT、SA-β-gal实验结果相似，再次证明了绿原酸对成纤维细胞的保护作用。以上结果均说明绿原酸能对抗乙二醛诱导的成纤维细胞衰老，保护细胞免受损伤，推测保护机制可能是绿原酸阻碍了乙二醛向AGE发展，减少AGE带来的损伤。

综上所述，利用乙二醛可以重建成纤维细胞衰老模型。在该衰老上加入绿原酸后，细胞增殖能力，SA-β-gal及p16INK4a mRNA表达均有改善，提示绿原酸在乙二醛致成纤维细胞衰老中具有潜在的保护作用。

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Inhibitory effect of chlorogenic acid on senescence of human skin fibroblasts

Chen Ting*,Jiang Zhimao,Yu Bo,Ma Gang.*Department of Dermatology,Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital,Shenzhen 518000,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of chlorogenic acid on senescence of human skin fibroblasts （HSFs）.MethodsFibroblasts isolated from human foreskin were treated with 1 mmol/L glyoxalin vitroto develop a model for cellular senescence.In order to select effective concentrations of chlorogenic acid,some HSFs were treated with 1 mmol/L glyoxal alone or in combination with chlorogenic acid at different concentrations（5,10,20,40,80 μmol/L）for 3 days,with those receiving no treatment serving as the blank control group.Then,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was performed to evaluate the proliferative activity of HSFs.Some HSFs were divided into 5 groups to be cultured alone（blank control group）,or treated with 1 mmol/L glyoxal（glyoxal group）or the combination of 1 mmol/L glyoxal and chlorogenic acid at effective concentrations of 10,20 and 40 μmol/L （glyoxal+chlorogenic acid groups）.Senescence associated β-galactosidase （SA-β-gal）staining and real-time fluorescence-based quantitative PCR were conducted to determine the percentage of senescent cells and expression level of p16INK4a mRNA respectively.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance followed by the least significant difference（LSD）-ttest.ResultsCompared with the blank control group,the glyoxal group showed significantly decreased cellular proliferative activity of HSFs（55.65% ±2.00%vs.100% ±6.90%,P＜0.01）,while chlorogenic acid increased the proliferative activity of HSFs in a dose-dependent manner,and the increase reached a peak at 40 μmol/L.Concretely speaking,the glyoxal+10-,20-,40-,80-μmol/L chlorogenic acid groups all significantly differed from the glyoxal group in cellular proliferative activity（60.75%±1.32%,67.65%±1.90%,75.71%±3.25%and 75.69%±2.38%vs.55.65%± 2.00%,allP＜ 0.05）,but no significant difference was observed between the glyoxal group and glyoxal+5-μmol/L chlorogenic acid group or between the glyoxal+40-μmol/L chlorogenic acid group and glyoxal+80-μmol/L chlorogenic acid group （bothP＞ 0.05）.Therefore,10-40 μmol/L was selected as the effective concentrations of chlorogenic acid.The glyoxal group showed significant increases in the percentage of senescent（SA-β-gal-positive）cells （35.65% ±2.24%vs.13.00%±2.22%,P＜0.01）and expression level of p16INK4a mRNA （2-ΔΔCt:1.00±0.06 vs.0.26±0.05,P＜0.01）compared with the blank control group,while the glyoxal+10-,20-,40-μmol/L chlorogenic acid groups showed significantly decreased percentage of senescent cells（31.50%±2.13%,22.31%±3.11%and 19.32%±3.01%respectively）and expression level of p16INK4a mRNA （2-ΔΔCt:0.88 ± 0.08,0.73 ± 0.06 and 0.68 ± 0.04 respectively）compared with the glyoxal group （allP＜0.05）.Additionally,the percentage of senescent cells decreased with the increase in chlorogenic acid concentrations in the glyoxal+chlorogenic acid groups.ConclusionChlorogenic acid can protect HSFs from glyoxal-induced senescence.

Skin aging;Fibroblasts;Glyoxal;Chlorogenic acid;Cell aging;Cell proliferation;p16INK4a mRNA

Ma Gang,Email:szmagang@medmail.com.cn

作者单位：518000深圳市妇幼保健院皮肤科（陈婷）；北京大学深圳医院中心实验室（江智茂），皮肤科（马刚、于波）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.005

马刚，Email：szmagang@medmail.com.cn

2015-09-07）

（本文编辑：周良佳 颜艳）