滇山茶、银线草、车桑子、重楼对黑素细胞株增殖活性和酪氨酸酶影响的研究

黄晓凤 刘海洋 郭美华 庞勤 邹菥 杨小燕 杨成 马骁 何黎

滇山茶、银线草、车桑子、重楼对黑素细胞株增殖活性和酪氨酸酶影响的研究

黄晓凤 刘海洋 郭美华 庞勤 邹菥 杨小燕 杨成 马骁 何黎

目的 探讨滇山茶、银线草、车桑子、重楼提取物的美白作用。方法 7种植物提取物（滇山茶枝叶提取物、滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物、滇山茶花蕾提取物、滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物、银线草提取物、车桑子提取物、重楼提取物）分别设立10、25、50、100、200、400、800 mg/L 7个浓度作用于体外培养人表皮黑素细胞株，同时设立阴性对照组、空白对照组和100 μg/ml熊果苷阳性对照组。采用噻唑蓝比色法测定植物提取物对黑素细胞增殖影响，体外氧化多巴反应法测定提取物对酪氨酸酶活性的影响。结果 对黑素细胞增殖活性的影响：400 mg/L滇山茶枝叶提取物，10～100 mg/L滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，10 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物和10～25 mg/L车桑子提取物对黑素细胞增殖活性的抑制作用与100 mg/L熊果苷相当（P＞0.05）。800 mg/L滇山茶枝叶提取物对HEM-m细胞增殖活性的抑制作用低于熊果苷（P＜0.05）。余不同浓度提取物对HEM-m细胞增殖的抑制作用均强于熊果苷（P＜0.05或P＜0.01）。对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：10 mg/L滇山茶枝叶提取物，10～400 mg/L滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，50～100 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物，10～50和400 mg/L银线草提取物，10～800mg/L车桑子提取物，10和100～200mg/L重楼提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用与100 mg/L熊果苷相当（P＞0.05）。10～25 μg/ml滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物对酪氨酸酶的抑制作用明显低于熊果苷（P＜0.05）。其余不同浓度的提取物对酪氨酸酶的抑制活性均优于熊果苷组（P＜0.05或P＜0.01）。结论 滇山茶、车桑子提取物于特定浓度时，能抑制酪氨酸酶活性。

植物提取物；黑素细胞；细胞增殖；酪氨酸酶

研究表明，天然植物有效成分除具有美白作用外，还具有安全、低毒等特性，已有学者对多种植物提取物进行研究证实有抑制酪氨酸酶作用［1］。云南山茶花也叫滇山茶，属于山茶科山茶属植物，原产云南省。银线草为金粟兰科植物，民间虽已有广泛应用，但对银线草的药理学研究鲜见报道。车桑子，属于无患子科车桑子属，云南省红河州、元谋等干热河谷地区种植较多。重楼，为延龄草科重楼属植物，云南是我国重楼最主要的产地之一。我们利用云南省植物资源优势，与中国科学院昆明植物所联合，着眼从滇山茶的花、枝、叶，银线草、车桑子、重楼中提取有效成分，通过作用于体外培养的人表皮黑素细胞株（HEM-m），与熊果苷作对比，观察不同浓度梯度的植物提取物对细胞增殖活性、酪氨酸酶活性影响，以筛选出具有美白作用的植物提取物。

一、资料

1.细胞来源：人黑素细胞-中色（HEM-m）购于美国Sciencell公司。

2.药品和试剂：滇山茶提取物、银线草提取物、车桑子提取物、重楼提取物由中国科学院昆明植物所提供。熊果苷、左旋多巴购于北京坛墨质检公司，MelM基础培养基及补充物、胰蛋白酶/EDTA溶液、胰蛋白酶中和溶液购于美国Sciencell公司，噻唑蓝购于美国Biosharp公司，TritonX-100购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

3.实验仪器：倒置显微镜购于德国Carl Zeiss公司，全自动酶标仪购于美国Biotek公司，低速自动平衡离心机购于长沙英泰公司，CO2孵箱、超净工作台购于美国Thermo公司。

二、方法

1.植物提取物的制备：滇山茶（Camellia reticulata Lindl）枝叶提取物：干燥滇山茶枝叶和花蕾分别粉碎，75%乙醇回流提取3次（每次2小时），回收溶剂，得到枝叶提取物。取部分该提取物溶于水，经过D101大孔树脂柱，水洗脱，除去糖类等物质，70%乙醇洗脱，回收溶剂，得到滇山茶枝叶和花蕾70%乙醇洗脱物。银线草（Chloranthus japonicas Sieb）提取物：干燥银线草全草粉碎，95%乙醇回流提取3次（每次2小时），回收溶剂。车桑子［Dodonaea viscosa（Linn.）Jacq.Enum］提取物及滇重楼 ［Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Fr.）Hand.-Mazz］提取物：干燥车桑子枝叶及滇重楼根茎粉碎，75%乙醇回流提取3次（每次2小时），回收溶剂。

2.HEM-m的培养：细胞冻存管放入37℃水槽复苏，将管内细胞重新悬浮。按5 000个细胞/cm2分配至多聚左旋赖氨酸包被T75培养瓶中，放入培养箱。第2天更换培养基以清除残留的二甲基亚砜（DMSO）和未附壁的细胞，细胞接近50%融合前，每隔1天更换1次培养基，细胞接近50%融合后每天更换，融合接近80%时传代培养。健康的细胞呈现树枝状形态，2～3 d细胞翻倍。

3.不同植物提取物对细胞增殖的影响：用噻唑蓝进行测定。用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液消化处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶中和液对其进行终止，离心后用MelM培养基将黑素细胞稀释成1×105个/ml，取稀释后液体接种于96孔板100 μl/孔，接种密度为104个/孔。过夜待细胞贴壁，吸去培养液，分别加入含药培养液（7种不同植物提取物的培养液终浓度分别为 10、25、50、100、200、400、800 mg/L，熊果苷100 mg/L）100 μl/孔，每个浓度均设立3个复孔。并设立阴性对照组（黑素细胞+黑素细胞培养基）和空白对照组（单纯黑素细胞培养基）。培养72 h，弃上清，PBS液冲洗细胞2遍，每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，继续培养4 h后吸弃上清，每孔加入DMSO 100 μl，置于振荡器上低速振荡10 min，用酶标仪测定标本吸光度（A）值，测定波长为490 nm。细胞增殖率=［（药物组平均吸光值-空白组平均吸光值）/（阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值）］×100%

4.黑素细胞酪氨酸酶活性的测定：按上述方法接种黑素细胞于96孔培养板并加入含药培养基作用72 h，弃上清PBS液冲洗细胞2次，分别于每孔中加入100 μl含1%TritonX-100（PBS液配置）溶液，振荡器上低速振荡30 min，放置于-20℃冰箱中1 h，室温下融化，使黑素细胞完全裂解。每孔加入100 μl浓度为0.1%L多巴溶液，继续置于37℃孵箱2 h，酶标仪测定标本吸光度（A）值，测定波长为490 nm。酪氨酸酶相对活性=［（药物组平均吸光值-空白组平均吸光值）/（阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值）］×100%。

5.统计学分析：采用SPSS17.0统计软件建立数据库，进行整理，计算均值，两组间计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.不同植物提取物对黑素细胞增殖活性的影响：与阴性对照组比较，除10 mg/L滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物和10 mg/L车桑子提取物对HEM-m细胞无明显影响外（P＞0.05），其余不同浓度植物提取物均显示对细胞增殖活性有一定的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。与阳性对照组熊果苷比较，400 mg/L滇山茶枝叶提取物，10～100 mg/L滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物10 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物，10～25 mg/L车桑子提取物对HEM-m细胞增殖活性的抑制作用与100 mg/L熊果苷相当（P＞0.05）。800 mg/L滇山茶枝叶提取物对HEM-m细胞增殖活性的抑制作用低于熊果苷（P＜0.05）。余不同浓度提取物对HEM-m细胞增殖的抑制作用均强于熊果苷（P＜0.05）。见表 1。

2.不同植物提取物对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：与阴性对照组比较，100 mg/L熊果苷和各浓度的植物提取物对HEM-m细胞酪氨酸酶活性均具有显著的抑制作用（P＜0.05）。与阳性对照组熊果苷比较，10 mg/L滇山茶枝叶提取物，10～400 mg/L滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，50～100 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物，10～50和400 mg/L银线草提取物，10～800 mg/L车桑子提取物，10和100～200 mg/L重楼提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用与100 mg/L熊果苷相当（P＞0.05）。10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物对酪氨酸酶的抑制作用明显低于熊果苷（P＜0.05）。其余不同浓度的提取物对酪氨酸酶的抑制活性均优于熊果苷组。见表2。

表1 不同植物提取物对黑素细胞增殖活性的影响（%，±s）

表1 不同植物提取物对黑素细胞增殖活性的影响（%，±s）

注：n=3。a：与阴性对照组比较，P ＜ 0.05；b：与阳性对照组比较，P ＜ 0.05

组别样品（mg/L）800 400 200 100 50 25 10熊果苷滇山茶枝叶提取物 74.82±7.60ab47.88±2.01a 7.07±4.83ab 1.67±0.57ab 6.09±0.65ab 9.11±7.65ab 12.59±7.72ab57.32±4.72a滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物10.07±1.85ab28.89±1.57ab24.34±5.39ab51.68±12.88a66.37±4.00a 66.42±14.00a 71.82±14.14 57.32±4.72a滇山茶花蕾提取物 44.25±1.36ab22.54±0.75ab 9.8±2.0ab 3.72±2.25ab18.59±9.86ab55.16±9.04a 55.64±1.84a 57.32±4.72a滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物9.59±1.85ab 0.67±0.50ab 0.07±0.03ab 2.44±1.70ab19.54±3.19ab36.81±8.41ab 34.41±10.88a57.32±4.72a银线草提取物 7.35±4.86ab 6.60±5.87ab 1.22±0.91ab11.46±2.42ab28.34±3.63ab26.87±7.47ab 31.33±7.90ab76.79±8.01a车桑子提取物 48.43±0.51ab26.69±1.62ab28.19±4.93ab44.68±2.95ab58.32±2.56ab60.87±5.85a 76.61±15.67 76.79±8.01a重楼提取物 0.063±0.049ab0.48±0.49ab 2.84±0.62ab 4.42±0.95ab 5.23±1.21ab 2.19±1.15ab 23.91±0.72ab76.79±8.01a

表2 不同植物提取物对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响（%，±s）

表2 不同植物提取物对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响（%，±s）

注：n=3。a：与阴性对照组比较，P ＜ 0.05；b：与阳性对照组比较，P ＜ 0.05

组别样品（mg/L）800 400 200 100 50 25 10熊果苷滇山茶枝叶提取物 4.58±0.25ab 3.73±0.96ab 0.08±0.05ab 0.18±0.04ab 1.1±0.86ab 1.1±1.25ab 12.04±2.31a 30.11±11.65a滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物2.39±1.14ab14.34±2.72a 27.40±1.49a 36.89±8.47a 44.36±6.44a 46.48±22.96a 44.36±19.82a30.11±11.65a滇山茶花蕾提取物 8.91±4.46ab 2.88±0.53ab10.00±1.4ab 7.38±4.85ab 2.59±2.61ab33.08±7.25a 45.21±3.22a 30.11±11.65a滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脱物5.17±1.18ab 4.16±1.62ab 2.98±1.07ab22.08±25.07a34.18±5.61a 74.13±13.12ab74.81±5.51ab30.11±11.65a银线草提取物 5.92±0.41ab 6.90±2.55a 2.47±1.26ab 4.95±3.38ab17.68±8.80a 25.29±7.09a 29.97±13.15a41.11±21.63a车桑子提取物 22.28±1.60a 25.02±1.26a 6.90±3.53a 22.01±1.86a 29.09±4.14a 42.44±7.03a 31.83±5.18a 41.11±21.63a重楼提取物 1.41±2.14ab 5.66±1.33ab 6.54±1.06a 7.34±2.11a 5.92±1.36ab 4.07±1.53ab 6.98±2.22a 41.11±21.63a

四、讨论

山茶属（CamelliaLinn）植物属于山茶科（Theaceae），全世界约有280余种，主要分布于热带及亚热带地区，我国有250种以上，主要产于西南部和东南部地区。目前韩国、日本对山茶花的花、枝、叶、果实提取物的药理学研究较多。Nakamura等［2］研究发现，山茶花花蕾提取物可抑制黑素生成、促进成纤维细胞分化。山茶花提取物可通过清除人类HaCaT细胞内活性氧ROS和增强抗氧化酶活性达到抗氧化作用［3］，山茶花油具有抗炎活性［4］，山茶花籽油提取物通过外用可以抑制基质金属蛋白酶（MMP-1）活性、诱导一型胶原蛋白合成此外［5］，山茶花籽油还可以减少经皮水分流失，恢复皮肤屏障［6］。国外研究大多集中在抗真菌［7］、抗炎活性［8］、抗氧化和自由基清除活性［9］等作用中。Yan 等［10］从车桑子地上部分提取出Dodoviscin A作用于B16-F10黑素瘤细胞，发现该单体提取物显著抑制黑素瘤细胞黑素合成的同时对细胞活性无影响。

本研究表明，滇山茶枝叶提取物于800 mg/L对细胞增殖影响与抑制酪氨酸酶活性作用均优于100 mg/L熊果苷，于400 mg/L时对细胞增殖影响与熊果苷相当，但其抑制酪氨酸酶活性作用优于熊果苷；10～100mg/L滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物、10～25mg/L滇山茶花蕾提取物及10～25mg/L车桑子提取物对细胞增殖和酪氨酸酶活性的抑制作用均与熊果苷的作用相当。可见上述植物提取物具有植物美白剂的应用前景。尽管银线草、重楼提取物抑制酪氨酸酶活性的作用显著，但其对细胞增殖率影响过大，能否作为美白剂开发，尚待研究。

将筛选出来的滇山茶枝叶提取物、滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物、滇山茶花蕾提取物、车桑子提取物这几个提取物间进行组间方差分析表明：从滇山茶不同提取工艺和方法来看，滇山茶枝叶提取物美白活性优于枝叶提取物70%乙醇洗脱物（P＜0.05）；从滇山茶不同的提取部位来看，滇山茶枝叶提取物美白活性优于花蕾提取物（P＜0.05）。滇山茶枝叶提取物具有最强的美白作用，各浓度滇山茶枝叶提取物70%乙醇洗脱物、滇山茶花蕾提取物及车桑子提取物之间美白作用差异无统计学意义（P＞0.05）。国外学者虽已提取出一部分具有抑制黑素生成的化学成分，但是涉及成分少，而且这类植物种属繁多，加至提取工艺、提取部位不同而各具功效。因此对滇山茶、车桑子在皮肤美白剂中的研发空间还很大。

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Effects ofCamellia retic ulata,Chloranthus japonicas,Dodonaea viscosaandParis polyphyllaon the proliferation of and tyrosinase activity in a melanocyte cell line

Huang Xiaofeng*,Liu Haiyang,Guo Meihua,Pang Qin,Zou Xi,Yang Xiaoyan,Yang Cheng,Ma Xiao,He Li.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University;Innovation Team of Ministry of Education,Collaborative Innovation Center of Yunnan Province;Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province,Kunming 650000,China

ObjectiveTo estimate the whitening effect of extracts ofCamellia reticulata,Chloranthus japonicas,Dodonaea viscosaandParis polyphylla.MethodsA human epidermal melanocyte cell line HEM-m was culturedin vitro,and classified into several groups to be treated with 7 concentrations（10,25,50,100,200,400,800 mg/L）of different plant extracts,includingCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract,extract ofCamellia reticulataalabastrum,70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulata alabastrum,Chloranthus japonicasextract,Dodonaea viscosaextract,andParis polyphyllaextract.At the same time,the negative control group,blank control group and positive control group（treated with 100 mg/L arbutin）were set up.After 72 hours of treatment,MTT assay was performed to detect cell proliferation,and dopa-oxidation assay to estimate tyrosinase activity in melanocytes.ResultsAs far as the inhibitory effect on the proliferation of HEM-m cells was concerned,400 mg/LCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract at 10－100 mg/L,extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L,70%ethanol-eluted fraction of extract of Camellia reticulataalabastrum at 10 mg/L andDodonaea viscosaextract at 10－25 mg/L were equivalent to（allP＞0.05）,800 mg/LCamellia reticulataleaf extract was significantly weaker than （P ＜ 0.05）,while the other concentrations of these plant extracts were significantly stronger than （P＜0.05 or 0.01）,100 mg/L arbutin.In the case of inhibitory effect on tyrosinase activity,100 mg/L arbutin was similar to 10 mg/LCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract at 10－400 mg/L,extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L,70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulataalabastrum at 50－100 mg/L,Chloranthus japonicasextract at 10－50 mg/L and 400 mg/L,Dodonaea viscosaextract at 10－800 mg/L andParis polyphyllaextract at 10 and 100－200 mg/L（allP＞0.05）,stronger than 70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L （P＜0.05）,but weaker than the other concentrations of these plant extracts（P＜0.05 or 0.01）.ConclusionSpecial concentrations ofCamellia reticulateandDodonaea viscosecan inhibit tyrosinase activity.

Plant extracts;Melanocytes;Cell proliferation;Tyrosinase

He Li,Email:drheli2662@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.019

650000昆明医科大学第一附属医院皮肤科、教育部创新团队、云南省协同创新中心、云南省工程技术研究中心（黄晓凤、郭美华、何黎）；中国科学院昆明植物所（刘海洋）；云南薇诺娜皮肤医疗美容中心（庞勤、邹菥、杨小燕、杨成）；昆明贝泰妮生物科技有限公司（马骁）

何黎，Email：drheli2662@126.com

2014-05-23）

（本文编辑：吴晓初）