卡介菌多糖核酸对Nc/Nga小鼠特应性皮炎的保护作用

郭亚南 王丽丽 文海泉 任勇 李颂

卡介菌多糖核酸对Nc/Nga小鼠特应性皮炎的保护作用

郭亚南 王丽丽 文海泉 任勇 李颂

目的 探讨卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）对Nc/Nga小鼠特应性皮炎皮损的预防作用及可能机制。方法 外用二硝基氯苯（DNCB）反复刺激新生Nc/Nga小鼠，通过皮炎评分、搔抓行为、组织病理学、免疫学指标评价皮炎损伤程度，观察BCG-PSN对小鼠皮损的预防作用。结果 出生后4周内重复注射BCGPSN，可以显著改善DNCB致敏Nc/Nga小鼠皮损炎症程度，降低皮炎评分以及小鼠的搔抓行为，不同浓度BCGPSN组之间搔抓频率差异无统计学意义。BCG-PSN可以降低血浆中IgE的含量，呈剂量依赖性。0.5 mg/kg BCGPSN可增加皮损中分泌干扰素（IFN）γ的细胞数量。不同剂量BCG-PSN均可降低脾单一核细胞培养上清液中IL-4的含量，增加IL-12的浓度。结论 早期注射BCG-PSN可通过促进分泌IFN-γ的细胞增生，增加IL-12合成，降低IL-4和IgE的含量，从而预防Nc/Nga小鼠皮炎发生。

皮炎，特应性；小鼠，Nc/Nga；树突细胞；卡介菌多糖核酸

卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）是从卡介菌中提取多糖、核酸混合而制成的新型免疫调节剂，我们前期实验发现，BCG-PSN可以促进AD患者PBMC中IL-12分泌，纠正Th1/Th2失衡状态［1］。我们的动物实验发现，BCG-PSN可能通过促进IL-12和IFN-γ分泌，抑制IgE合成，发挥治疗Nc/Nga小鼠特应性皮炎样皮损的作用［2］。早期注射BCG-PSN对于特应性皮炎是否有预防作用，经查阅文献，未发现相关研究。我们采用日本Nc/Nga小鼠作为小鼠特应性皮炎模型，观察BCG-PSN对Nc/Nga小鼠特应性皮炎皮损的影响，旨在为早期注射BCG-PSN预防特应性皮炎的发生提供依据。

材料和方法

一、动物与试剂

从日本Charles River Laboratories公司购得6周龄SPF级Nc/Nga小鼠（合格证号110600109000211），自由交配，选择出生24 h内Nc/Nga幼鼠16只，3只母鼠所生，前4周以各自母鼠母乳喂养，4周后分笼饲养。饲养条件为清洁级环境，12 h光照/12 h黑暗，室温为22～25℃，湿度为40%～70%，自由饮水进食。BCG-PSN购于湖南九芝堂医药贸易有限公司，二硝基氯苯（DNCB）购于北京市化学试剂公司，兔抗小鼠IFN-γ抗体和羊抗兔IgG（二抗）购于武汉博士德生物工程有限公司，小鼠 IL－4、IL－12、IgE 酶联免疫检测试剂盒购于美国Invitrogen公司。

二、方法

1.给药：16只Nc/Nga新生小鼠分为3个组，正常对照组4只，低浓度组（0.1 mg/kg BCG-PSN）5只，高浓度组（0.5 mg/kg BCG-PSN）7 只。鼠龄 1、8、15、22 d：正常对照组小鼠分别于皮下注射生理氯化钠溶液，低浓度组小鼠分别注射0.1 mg/kg BCG-PSN，高浓度组小鼠分别皮下注射0.5 mg/kg BCG-PSN。

2.皮损诱导：参考DNCB诱发Nc/Nga小鼠皮炎的文献稍有改进［3-4］，鼠龄第49天，用含1%DNCB的丙酮溶液致敏各组Nc/Nga小鼠背部除毛后皮肤，第56、63、70天外用含0.1%DNCB的丙酮溶液进行激发。试验过程中小鼠健康，未出现死亡。

3.观察指标：

（1）皮损严重程度：第 57、64、71 天观察小鼠，进行皮炎评分并拍照。皮炎评分按以下方法进行：观察皮肤红斑、鳞屑、表皮干燥、结痂等情况，按严重程度计分：无症状计0分、轻微计1分、中度计2分、严重计 3分，计算所有症状的分数［3］。

（2）小鼠搔抓行为：第 57、64、71天将小鼠单独放置，观察10 min内小鼠搔抓耳部、背部的次数，连续搔抓算作1次。

（3）血清 IgE 含量：第 57、64、71天眼眶后静脉取血，抗凝血在4℃下1 600×g离心30 min，获取血浆，冻存于-20℃，待测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中细胞因子的浓度。

（4）Nc/Nga小鼠脾脏单一核细胞培养液中IL-4、IL-12的含量：小鼠脱颈处死后，无菌取脾脏置于消毒平皿中；取脾脏单一核细胞，调节细胞浓度为1×106/ml，接种至24孔培养板，培养48 h后收集上清液。用ELISA方法检测IL-4、IL-12的含量。

（5）组织病理：第72天处死小鼠后，背部皮损组织用4%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色后显微镜下观察组织病理改变。

（6）Nc/Nga小鼠干扰素（IFN）γ的表达：用免疫组化法检测小鼠组织病理中IFN-γ的表达水平。

4.统计学处理：SPSS 16.0统计软件分析数据。计量资料以±s表示。多个样本之间采用单因素方差分析，用方差齐性检验，如方差不齐，采用Dunnetts T3方法进行两两比较，如方差齐，采用Bonferroni分析，进一步比较两两之间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.BCG-PSN对Nc/Nga小鼠皮炎评分的影响：早期接种BCG-PSN可以减轻由外用DNCB引起的皮炎。第57、64、71天，低浓度组皮炎评分与正常对照组相比，P值分别为 0.005、0.261、0.014，高浓度组与正常对照组相比，P值分别为0.000、0.002、0.000。第71天高浓度组与低浓度组之间差异有统计学意义，P＝ 0.013。见表1。

2.BCG-PSN对小鼠搔抓频率的影响：早期注射低浓度BCG-PSN可以明显降低DNCB致敏Nc/Nga小鼠搔抓频率，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＝ 0.000、0.007、0.000），高浓度 BCG-PSN 明显降低搔抓频率，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＝ 0.00、0.00、0.00）。BCG-PSN两个剂量之间差异无统计学意义，P＝ 0.058、0.074、0.051。见表2。

3.Nc/Nga小鼠各组第57、64、71天血浆IgE含量：早期多次注射BCG-PSN可以降低血浆中IgE的含量。第57、64、71天，低浓度组与正常对照组相比，P值分别为0.000、0.000、0.000；高浓度组与正常对照组相比，P值分别为 0.000、0.000、0.000。高浓度BCG-PSN能更有效的降低血浆内IgE的含量，第57、64、71天，高浓度组与低浓度组比较，P值分别为 0.001、0.009、1。见表 3。

表1 Nc/Nga小鼠各组不同时间皮炎评分（±s）

表1 Nc/Nga小鼠各组不同时间皮炎评分（±s）

注：a：与正常对照组比较，P ＜ 0.05；b：与低浓度组比较，P ＜ 0.05

组别 只数 57 d 64 d 71 d正常对照组 4 7±0.82 8.75±0.96 9.75±0.96低浓度组 5 4.8±0.84a 7.4±1.14a 7.6±1.14a高浓度组 7 4±0.82a 5.7±1.11a 5.71±0.78ab

表2 Nc/Nga小鼠各组搔抓频率（±s）

表2 Nc/Nga小鼠各组搔抓频率（±s）

注：a：与正常对照组比较，P＜0.05

组别 只数 57 d 64 d 71 d正常对照组 4 5±0.82 6.75±0.96 8.5±0.58低浓度组 5 2.4±0.55a 4.2±0.84a 4.8±0.84a高浓度组 7 1.23±0.76a 2.7±1.11a 3.43±0.98a

4.Nc/Nga小鼠各组脾单一核细胞培养上清液IL-4、IL-12的含量：Nc/Nga小鼠早期皮下注射低浓度、高浓度的BCG-PSN，均可降低DNCB激发的Nc/Nga小鼠脾脏单一核细胞培养上清液中IL-4的含量，与正常对照组相比，差异有统计学意义，P值分别为0.000、0.000。可增加IL-12含量，与正常对照组比较，差异有统计学意义，P值分别为0.000、0.000。高浓度BCG-PSN可明显降低IL-4和提高IL-12的含量，与低浓度BCG-PSN比较，差异有统计学意义，P值分别为0.013、0.002，见表4。

表3 Nc/Nga小鼠各组第57、64、71天血浆IgE浓度（μg/L，±s）

表3 Nc/Nga小鼠各组第57、64、71天血浆IgE浓度（μg/L，±s）

注：a：与正常对照组比较，P ＜ 0.05；b：与低浓度组比较，P ＜ 0.05

组别 只数 57 d 64 d 71 d正常对照组 4 38.45±3.09 58.77±4.5 70.9±2.97低浓度组 5 25.2±4.77a 32.69±3.92a 39.38±4.8a高浓度组 7 16.09±1.9ab 24.38±3.51ab 37.15±4.68

表4 Nc/Nga小鼠各组单一核细胞培养上清液中IL-4、IL-12的含量（ng/L，±s）

表4 Nc/Nga小鼠各组单一核细胞培养上清液中IL-4、IL-12的含量（ng/L，±s）

注：a：与正常对照组比较，P ＜ 0.05；b：与低浓度组比较，P ＜ 0.05

组别 只数 IL-4 IL-12正常对照组 4 50.26±5.24 19.78±5.11低浓度组 5 32.56±4.62a 36.44±3.48a高浓度组 7 23.91±3.39ab 47.81±4.43ab

5.Nc/Nga小鼠各组背部皮肤组织病理学：正常对照组小鼠组织病理提示有角化过度、棘层肥厚、基底细胞空泡化，真皮增厚、较多淋巴细胞浸润。早期多次注射低浓度BCG-PSN可以减少后期DNCB致敏Nc/Nga小鼠炎症程度，表现为基底层细胞空泡化消失，真皮内稀疏淋巴细胞浸润；早期多次注射高浓度BCG-PSN可以明显减轻小鼠炎症程度，组织病理图片提示轻微角化过度，棘层恢复正常，真皮内散在少许淋巴细胞浸润，见图1～3。

6.Nc/Nga小鼠各实验组背部皮损IFN-γ的表达：用高浓度BCG-PSN早期处理Nc/Nga小鼠，经DNCB致敏后，其真皮内有较多分泌IFN-γ的细胞，低浓度BCG-PSN早期处理的小鼠和正常对照组小鼠真皮内未见明显的分泌IFN-γ的细胞。见图4。

图1 正常对照组小鼠背部组织角化过度、棘层肥厚、基底细胞空泡化，真皮增厚、较多淋巴细胞浸润（HE×40）

图2 低浓度组表现为基底层细胞空泡化消失，真皮内稀疏淋巴细胞浸润（HE×40）

图3 高浓度组提示轻微角化过度，棘层恢复正常，真皮内散在少许淋巴细胞浸润（HE×40）

图4 Nc/Nga小鼠背部皮损干扰素γ的表达（免疫组化 ×40） 正常对照组（4A）及低浓度组（4B）小鼠真皮内未见分泌IFN-γ的细胞，高浓度组（4C）小鼠真皮内有较多分泌干扰素γ的细胞

讨 论

一些研究结果表明，BCG-PSN是较强的Th1型细胞因子活化剂，可以促进IFN-γ的表达。林恩尧等［4］研究表明，经BCG-PSN免疫的豚鼠，外周血的T淋巴细胞明显增加，但是早期注射BCG-PSN是否可以防止过敏性疾病的发生未见相关报道。AD是一种慢性瘙痒性皮肤病，通常与过敏性鼻炎和哮喘等过敏性疾病相关［5-6］。Nc/Nga鼠是日本一种名叫Nishiki的宠物鼠，1997年Matsuda等对其进行了基础和临床研究，正式确立它作为AD模型。当Nc/Nga小鼠在普通环境下饲养时，它们在第8周开始出现搔抓行为，皮肤开始变得干燥并覆盖鳞屑；在以后的几个星期，小鼠的耳朵、背部、颈部和面部出现皮损。普通环境下Nc/Nga小鼠皮损免疫组化显示有过度角化、棘层肥厚、角化不全，所有的这些表现与AD患者身上所观察到的皮损非常相似［7-8］。小鼠皮损还提示有淋巴细胞浸润、巨噬细胞浸润，肥大细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒［9-11］。

我们前期实验［2］利用DNCB重复刺激Nc/Nga小鼠皮肤，成功的建立特应性皮炎小鼠模型，由于部分小鼠在用5%DNCB刺激后，出现较为严重的溃疡、出血。为避免出现类似结果，我们将Nc/Nga小鼠背部毛发除掉后，涂抹1%的DNCB致敏，0.1%的DNCB重复刺激3次。结果发现，正常对照组小鼠第1次重复刺激后，小鼠背部出现鳞屑、红斑及皮肤干燥，第2次重复刺激后，小鼠背部出现红斑、鳞屑，第3次重复刺激后，小鼠背部严重红斑、厚痂。早期多次注射BCG-PSN可以缓解DNCB所致的皮炎严重程度，低浓度组小鼠早期出现少量抓痕和红斑，后期皮肤干燥有较多鳞屑，未见明显红斑及结痂；高浓度组小鼠早期仅有皮肤干燥，后逐渐出现少许鳞屑。皮炎评分进一步证实，BCG-PSN对于特应性皮炎样皮损有保护作用。早期多次注射低浓度和高浓度BCG-PSN可以明显减少DNCB对成年Nc/Nga小鼠造成的搔抓行为，不同剂量BCG-PSN之间搔抓频率无差异。我们的实验还发现，早期多次注射BCG-PSN可以降低Nc/Nga小鼠血浆中IgE的含量，呈剂量依赖性。组织病理学提示正常对照组小鼠有过度角化、棘层肥厚、基底细胞空泡化，真皮增厚、有大量淋巴细胞浸润；早期多次注射低浓度的BCG-PSN可以减少后期DNCB致敏Nc/Nga小鼠炎症程度，表现为基底层细胞空泡化消失，真皮内淋巴细胞减少；早期多次注射高浓度BCG-PSN可以明显减轻小鼠炎症程度，组织病理图片提示轻微角化过度，棘层恢复正常，真皮内稀疏淋巴细胞。以上结果说明，早期多次注射BCG-PSN对于Nc/Nga小鼠特应性皮炎样皮损炎症程度的改善有益。

Sugiura等［12］检测5～28周龄普通环境下饲养的Nc/Nga鼠，发现皮损中分泌IL-4和IL-5的细胞明显增多，并且随周龄增长而增加，而分泌IFN-γ的细胞在21周前非常稀少，21周后才开始出现。Gately等［13］认为IL-12在免疫反应中可诱导IFN-γ产生，对IL-4的产生起抑制作用，从而诱导免疫反应朝着Th1型方向发展。IFN-γ有抑制Th2类细胞因子IL-4，IL-5的产生，促使Th0向Th1分化，抑制其向Th2分化的作用，并可阻断IgE的合成，减少嗜酸性粒细胞的浸润和活化。IFN-γ可以加强IL-12诱导Th1细胞产生的能力，而IL-12本身又能诱导IFN-γ的产生。这样，形成一个正反馈的调节，加强了Th1的免疫反应，抑制了Th2的免疫反应［14］。我们通过免疫组化染色发现，高浓度BCG-PSN组小鼠皮损内分泌IFN-γ的细胞大量出现，而单一核细胞培养上清液中IL-4含量与正常对照组相比，明显下降，IL-12的含量明显增高。我们认为早期多次皮下注射高浓度的BCG-PSN，可诱导分泌IFN-γ细胞产生，促进IL-12分泌，抑制IL-4和IgE的合成，从而减轻皮损炎症程度，发挥早期干预的作用。

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Protective effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin against atopic dermatitis in Nc/Nga mice

Guo Yanan*,Wang Lili,Wen Haiquan,Ren Yong,Li Song.*Shandong Provincial Hospital,Shandong University,Jinan 250021,China

Li Song,Email:123250349@qq.com

Objective To evaluate the protective effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin（BCG-PSN）against atopic dermatitis（AD）in Nc/Nga mice,and to explore its possible mechanism.Methods Sixteen Nc/Nga mice were classified into normal control group （n=4）,low-concentration BCG-PSN group （n=5）and high-concentration BCG-PSN group （n=7）to be subcutaneously injected with sodium chloride physiological solution,BCG-PSN of 0.1 mg/kg and 0.5 mg/kg respectively,at 1,8,15 and 22 days of age.Dinitrochlorobenzene（DNCB）was repeatedly and topically applied to these Nc/Nga mice to induce AD-like lesions at 49 days of age.The preventive effect of BCG-PSN against AD was evaluated by dermatitis scores,scratching frequency,histopathological manifestations and immunological parameters（including IgE,interleukin（IL）-4 and-12,and interferon（IFN）-γ）.Results Repeated injection of BCG-PSN within 4 weeks after birth significantly decreased the severity of DNCB-induced AD-like lesions,dermatitis scores and scratching behavior in Nc/Nga mice.There was no statistical difference in scratching frequency between the high-and low-concentration BCG-PSN groups.BCG-PSN treatment reduced the plasma level of IgE in Nc/Nga mice in a dose-dependent manner.BCG-PSN at 0.5 mg/kg increased the number of cells secreting IFN-γ in skin lesions of mice.Both doses of BCG-PSN down-regulated IL-4 level,but up-regulated IL-12 level in the culture supernatant of spleen mononuclear cells from mice.Conclusion Early injection of BCG-PSN could protect Nc/Nga mice against dermatitis by promoting the proliferation of IFN-γsecreting cells,increasing the synthesis of IL-12,and reducing the levels of IL-4 and IgE.

Dermatitis,atopic;Mice,Nc/Nga;Dendritic cells;BCG-PSN

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.011

250021济南，山东大学附属省立医院（郭亚南、任勇、李颂）；济南市第五人民医院（王丽丽）；中南大学湘雅二医院（文海泉）

李颂，Email：123250349@qq.com

2014-06-24）

（本文编辑：吴晓初）