特应性皮炎患者外周血T细胞磷酸肌醇3激酶信号转导通路的表达

魏明 涂玲 梁颖红 刘佳 龚艳杰 张俊华 张宜花

特应性皮炎患者外周血T细胞磷酸肌醇3激酶信号转导通路的表达

魏明 涂玲 梁颖红 刘佳 龚艳杰 张俊华 张宜花

目的 探讨特应性皮炎（AD）患者外周血T细胞磷酸肌醇3激酶（PI3K）信号转导通路活化情况及其临床意义。方法 检测38例AD患者的T细胞PI3K通路活性，健康对照组38例。外周血T淋巴细胞分离采用Rosettsep T细胞提取试剂盒提取，PI3K活性采用免疫沉淀和酶联免疫吸附试验（ELISA），Akt及其磷酸化蛋白采用免疫印迹法，T细胞增殖采用噻唑蓝（MTT），白细胞介素（IL）6和IL-10水平采用ELISA检测。结果 新鲜分离的AD患者外周血T细胞PI3K和Akt活性均显著高于健康对照组（P<0.05）。AD患者T细胞在体外培养24 h后PI3K和Akt活性与健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），健康对照组T细胞用AD患者血清孵育24 h后PI3K和Akt活性显著增高（P<0.05）。PI3K特异性抑制剂LY294002显著抑制AD患者T细胞增殖［（123±25）%和（195±28）%，P<0.05］及分泌IL-6和IL-10分别为［（431±64）ng/L和（823 ± 128）ng/L，P<0.05］，［（120 ± 21）ng/L和（213 ± 35）ng/L，P<0.05］。新鲜分离的 AD 患者外周血T细胞PI3K和Akt活性与疾病严重程度指数（EASI）无相关。结论 AD患者外周血T细胞存在磷酸肌醇3激酶信号转导通路活化异常，并与T细胞增殖和细胞因子分泌有关，提示AD患者外周血中可能存在激活该通路的血清因子。

皮炎，特应性；T淋巴细胞；信号传导

特应性皮炎（AD）是一个慢性多因素的疾病［1］，病因尚不清楚，其发病机制至今尚未完全明确。在AD的发病机制中，T细胞可能起着关键作用［2-5］。磷酸肌醇3激酶（PI3K）是调控T细胞增殖、活化和迁移的关键信号蛋白，正常静止的T细胞PI3K活性处于低水平状态，只有在T细胞活化时PI3K活性才显著升高。为此，我们通过检测AD患者外周血T细胞PI3K信号通路活性情况，探讨其在AD发病机制中的作用。

对象与方法

一、对象

2010年7月至2013年11月就诊于我院门诊的AD患者38例（儿童34例，成人4例自幼患病），全部符合Williams特应性皮炎诊断标准［6］。其中男8例，女30例，年龄2～60岁，平均22.5岁，按照湿疹面积及严重程度指数（EASI）评分法［7］对AD患者病情严重程度进行评分，患者EASI评分为3.5～14.1分，平均（6.23±2.71）分。所有患者无其他明显皮肤病变、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病、肝病和肿瘤等病史。停用抗组胺药2周以上，停用系统及局部糖皮质激素及其他免疫抑制剂1个月以上。健康对照组38例，来自我院健康体检中心体检健康者，其中男8例，女30例，年龄3～60岁，平均23.5岁。无家族过敏史，无明显皮肤病变或内脏疾病史。两组受试者性别、年龄差异无统计学意义。本实验经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

二、方法

1．外周血T细胞的分离和培养：抽取患者和对照组外周静脉血6～8 ml，按Rosettsep T细胞提取试剂盒（加拿大StemCell Technologies公司）说明书分离T细胞。用抗CD3单抗（美国BD Pharmingen公司）在流式细胞仪上检测T细胞纯度，发现T细胞纯度均在95%以上。把分离到的T细胞用RPMI 1640培养基和10%胎牛血清（FBS，均购自美国Gibco公司）培养，并按实验要求部分细胞用CD3单抗（5 ml/L，购自美国Biosciences公司）和 CD28单抗（5 mg/L）或 PI3K 抑制剂 LY294002（10 μmol/L，购自美国Chemicon公司）处理细胞。同时，用锥虫蓝拒染法检测细胞活性，细胞活性均超过95%。

2．血清的制备和处理：常规收集血清后储存于－80℃待用。为了解AD患者血清是否影响健康对照组，使用前把AD患者血清在56℃灭活30 min，然后离心除去沉淀物，备用。

3．提取细胞总蛋白：用冷1×PBS洗涤T细胞1次，加入50 μl SDS样本裂解缓冲液A，匀浆后置冰上，超声粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上；850×g离心5 min，吸取上清，分装储存于－20℃。

4．PI3K活性检测：2×106T细胞用无血清培养基洗涤后置于冰上，加2 ml冰缓冲液A（137 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L正钒酸盐溶液），洗涤3次后加入0.5 ml裂解液，继续置冰上20 min；裂解细胞后转移至1 ml离心管离心10 min以沉淀未溶解物质，把离心后的上清转至另一离心管；加入5 μl抗PI3K抗体，于4℃孵育1 h；然后加60 μl 50%蛋白A微珠（溶于PBS），混合后再于4℃孵育1 h；离心后所得沉淀物用50 mmol/L Tris-HC（lpH7.4）洗涤3次；然后按美国Echolon公司提供的试剂盒说明书操作，用ELISA法检测PI3K活性。

5．免疫印迹法：把样品蛋白于95～100℃煮5min，然后等量上样于15%SDS-PAGE凝胶上进行电泳，用转移缓冲液把凝胶上蛋白质转移至醋酸纤维膜上，然后膜与不同浓度一抗于4℃孵育过夜，接着膜在室温下与二抗孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液显影，最后将结果进行图像分析，计算吸光度（A）值，Akt活性以磷酸化AktA值/总AktA值之比表示。

6．噻唑蓝（MTT）测定：为检测T细胞增殖情况，将实验分为3组，即单独血清培养、CD3/CD28单抗刺激、CD3/CD28单抗刺激 +LY294002，每组均设3个复孔。把1×105T细胞在含100 μl RPMI 1640培养液的96孔组织培养板中培养48 h。MTT比色法具体步骤见文献［8］。

7．细胞因子水平检测：按说明书步骤操作。

结 果

1．T细胞PBK信号通路活性情况：AD患者外周血T细胞PI3K活性（1.00%±0.81%）显著高于健康对照组（0.50% ± 0.25%），t=2.417，P<0.05。AD患者外周血T细胞PI3K下游关键蛋白Akt活性（1.05%±0.78%）显著高于健康对照组（0.49%±0.26%），t=2.435，P<0.05。

2．AD患者T细胞在含10%胎牛血清培养基中培养24 h后PI3K通路活化情况：AD患者T细胞经体外培养24 h后其PI3K和Akt活性为0.67%±0.36%和0.56%±0.32%，与健康对照组0.50%±0.25%和0.49%±0.26%比较，差异无统计学意义，t值分别为 1.028，1.061，均P＞ 0.05。

3．AD患者血清对健康对照组T细胞PI3K信号通路活性的影响：AD患者T细胞与其自身血清培养后，PI3K活性和Akt活性高于用健康对照组血清培养，均P＜0.05，见表1。健康对照组T细胞与AD血清培养后，PI3K活性和Akt活性亦明显高于与其自身血清培养，均P＜0.05，见表1，提示AD患者血清中可能存在影响其T细胞PI3K通路异常活化的因素。

4．抑制PI3K通路活性对AD患者T细胞增殖的影响：PI3K特异性抑制剂LY294002+AD患者单独血清培养T细胞增值率为63%±11%与单独血清培养T细胞增值率123%±25%相比，t=2.687，P<0.05。PI3K特异性抑制剂LY294002+CD3/CD28单抗刺激的AD患者T细胞增殖率为125%±22%与CD3/CD28单抗刺激的AD患者T细胞增殖率195% ±28%，t=2.219，P<0.05。提示PI3K特异性抑制剂LY294002对单独血清和CD3/CD28单抗刺激的AD患者T细胞增殖均有显著地抑制作用。

5．抑制PI3K通路活性对AD患者T细胞分泌细胞因子的影响：PI3K特异性抑制剂LY294002+AD患者T细胞体外自发分泌IL-6和IL-10与无抑制剂体外培养相比，均P<0.05，见表2。PI3K特异性抑制剂LY294002+CD3/CD28单抗诱导的IL-6和IL-10与CD3/CD28单抗诱导相比，均P<0.05，见表2。提示PI3K特异性抑制剂LY294002对AD患者T细胞体外自发分泌和CD3/CD28单抗诱导的IL-6和IL-10均有显著抑制作用。

6．AD患者T细胞PI3K通路活性与AD疾病严重程度积分的相关性：AD患者T细胞PI3K活性和Akt活性与AD疾病严重程度指数（EASI）均无相关关系，r值分别为0.25和0.29，P值分别为0.08和0.13。

表1 特应性皮炎（AD）患者和健康对照血清对T细胞PI3K信号通路活性的影响（%，±s）

表1 特应性皮炎（AD）患者和健康对照血清对T细胞PI3K信号通路活性的影响（%，±s）

注：a：与T细胞 +对照血清培养比较，t=2.032，P＜0.05；b：与T细胞+对照血清培养比较，t=2.472，P＜0.05；c：与T细胞 +自身血清培养比较，t=2.015，P＜0.05；d：与T细胞 +自身血清培养比较，t=2.496，P ＜ 0.05

组别 例数PI3K活性 AKt活性AD患者T细胞+自身血清培养 381.02±0.63a 1.12±0.59b T细胞+对照血清培养 380.62±0.27 0.53±0.26健康对照T细胞+AD患者血清培养 380.89±0.33c 1.03±0.56d 0.50±0.25 0.49±0.26 T细胞+自身血清培养 38

表2 抑制PI3K通路活性和CD3/CD28单抗对特应性皮炎（AD）患者T细胞分泌细胞因子的影响（±s）

表2 抑制PI3K通路活性和CD3/CD28单抗对特应性皮炎（AD）患者T细胞分泌细胞因子的影响（±s）

注：a：与无抑制剂AD患者T细胞培养比较，t=2.242，P＜0.05；b：与无抑制剂AD患者T细胞培养比较，t=2.013，P＜0.05；c：与CD3/CD28单抗诱导培养比较，t=2.429，P＜0.05；d：与CD3/CD28单抗诱导培养比较，t=2.143，P＜0.05

IL-6（ng/L） IL-10（ng/L）168±33a 56±14b 265±46 98±25 431±64c 120±21d 823±128 213±35组别 例数LY294002+AD患者T细胞培养 38无抑制剂AD患者T细胞培养 38 LY294002+CD3/CD28单抗诱导 38 CD3/CD28单抗诱导培养 38

讨 论

PI3K是由调节亚基和催化亚基组成的异源二聚体，在静息细胞中以无活性的P85-P110复合物存在于胞质中，当被激活后在细胞膜上生成（3，4，5）-磷酸化磷脂酰肌醇（PIP3），然后以此作为第二信使激活下游蛋白如Akt，从而诱导细胞内一系列信号蛋白变化，参与调控蛋白合成、肌动蛋白聚合、细胞生存和增殖等细胞生化过程［9］。Akt是PBK下游最为关键的信号蛋白。近年研究表明，PI3K信号通路不仅参与T细胞迁移，而且在CD3和（或）CD28介导的T细胞活化、增殖和存活中起着关键性的调节作用［10-11］。

本文结果显示，AD患者新鲜分离的外周血T细胞PI3K和Akt活性显著高于健康对照组。AD患者T细胞经体外用胎牛血清孵育24 h后，原来增高的PI3K通路活性能够被逆转至正常水平；AD患者T细胞与健康对照组血清培养后，PI3K通路活性也显著下降，而健康对照组T细胞与AD患者血清培养后其PI3K通路活性则明显增高。提示AD患者外周血T细胞中异常增高的PI3K通路活性可能是继发性的，可能与其血清中存在某种致病因子有关。有研究［12］发现，特应性皮炎患者急性皮损中Th17细胞可能通过增强Th2记忆细胞功能、促进角质形成细胞免疫活性，诱导TGF-1、IL-11、IL-6等炎症因子表达，推测当PI3K被炎性因子激活后，可以将P2转变成第二信使P3（也称PIP3），PIP3可以和PKB的PH结构域结合，使PKB磷酸化，引起细胞核内靶基因的变化，从而参与特应性皮炎炎症反应和组织重塑等生理病理过程。

为进一步探讨AD患者外周血T细胞中PI3K通路活化的临床意义，我们研究了PI3K通路与T细胞增殖、细胞因子分泌和AD疾病活动性的关系。结果显示，通过特异抑制异常增高的PI3K活性可显著抑制AD T细胞增殖和分泌IL-6和IL-10等细胞因子，提示AD患者外周血T细胞中PI3K通路异常活化可能与其体内T细胞的内在活化有关。因此推测T细胞的病理性活化可能是AD发病机制中的关键环节，PI3K通路很可能是调节AD T细胞活性的重要靶点，通过抑制该通路活性可能有利于AD的治疗。本研究未发现PI3K活性与AD活动指数存在相关性，或许与病例数偏少还是与其他原因有关，尚待进一步研究。

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Expression of the phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway in peripheral blood T cells from patients with atopic dermatitis

Wei Ming*,Tu Ling,Liang Yinghong,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Junhua,Zhang Yihua.*Department of Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

Objective To estimate the activity of the phosphatidylinositol3-kinase（PI3K）signaling pathway in peripheral blood T cells from patients with atopic dermatitis （AD）,and to investigate its clinical significance.Methods T cells were isolated by using the Rosettsep T cell purification kit from the peripheral blood of 38 patients with AD and 38 healthy human controls,and classified into several groups to be treated with anti-CD3 monoclonal antibody,anti-CD28 monoclonal antibody,and LY294002 （an inhibitor of PI3K）respectively.The activity of PI3K signaling pathway in T cells was estimated by immunoprecipitation and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Western blot was performed to measure the expressions of total Akt and phosphorylated Akt in T cells,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay to examine the proliferation of T cells,and ELISA to determine the levels of interleukin 6 （IL-6）and IL-10.Results The activity of PI3K and Akt was significantly higher in freshly isolated patient-derived T cells than in control-derived T cells （bothP<0.05）.However,the difference in the activity of PI3K and Akt between patient-derived and control-derived T cells disappeared （bothP>0.05）after 24-hourin vitroculture.The activity of PI3K and Akt in control-derived T cells was significantly increased after 24-hour incubation with sera from the patients with AD （bothP<0.05）.In addition,compared with patient-derived T cells treated with patients′sera or anti-CD3/CD28 monoclonal antibody alone,those treated with the combination of LY294002 and patients′sera or anti-CD3/CD28 monoclonal antibody showed a significant decrease in the proliferative activity（63%±11%vs.123%±25%,125%±22%vs.195%±28%,bothP<0.05）,supernatant levels of IL-6（（168 ± 33）vs.（265 ± 46）ng/L,（431 ± 64）vs.（823 ± 128）ng/L,bothP<0.05）and IL-10（（56 ± 14）vs.（98 ± 25）ng/L,（120 ± 21）vs.（213 ± 35）ng/L,bothP<0.05）.Eczema area and severity index （EASI）was unassociated with the activity of PI3K or Akt in fresh T cells from patients with AD （bothP>0.05）.Conclusions The PI3K signaling pathway is abnormally activated in peripheral blood T cells from patients with AD,which is associated with the proliferation of,as well as secretion of cytokines by,T cells,suggesting that there exist serum factors activating this pathway in peripheral blood of patients with AD.

Dermatitis,atopic;T-Lymphocytes;Signal transduction

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.009

450052郑州大学附属第五医院检验科（魏明、涂玲、梁颖红、龚艳杰、张俊华、张宜花），皮肤科（刘佳）

魏明，Email：gushiweiming@126.com

2014-02-26）

（本文编辑：吴晓初）