李世林 唐 梁 叶海霞 蒲小勇 王怀鹏
1.广州市第一人民医院南沙医院泌尿外科(广州 511457); 2. 广州市第一人民医院南沙医院中医科;
3. 广州市第一人民医院南沙医院神经内科; 4. 广东省人民医院泌尿外科
清浊祛毒丸联合针刺对实验性大鼠慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用*
李世林1**唐 梁2叶海霞3蒲小勇4王怀鹏4
1.广州市第一人民医院南沙医院泌尿外科(广州 511457); 2. 广州市第一人民医院南沙医院中医科;
3. 广州市第一人民医院南沙医院神经内科; 4. 广东省人民医院泌尿外科
目的 探讨清浊祛毒丸联合针刺对实验性大鼠慢性非细菌性前列腺炎(CNP)的治疗作用及分子机制。方法 选择10月龄健康雄性Wistar大鼠72只,随机分为正常对照组、安慰剂组、西药组、中药组、针刺组及联合治疗组(简称联合组),每组各12只。采用去势加大鼠后背皮下注射17β雌二醇(17β-E2)制作CNP模型,造模成功后除正常对照组及安慰剂组给予生理盐水治疗外,其他各组分别予坦索罗辛加塞来昔布胶囊、清浊祛毒丸、针刺、清浊祛毒丸加针刺治疗。治疗周期为30d。治疗结束后处死大鼠,显微镜下观察大鼠前列腺组织病变情况,采用ELISA法检测前列腺液中 IL-1β/TNF-α的表达水平,Western blot 检测MIF蛋白的表达情况,统计分析各组指标的变化差异。 结果 实验各组均成功造模,6组在前列腺组织炎症程度、前列腺液中 IL-1β/TNFα的表达水平、前列腺组织中MIF蛋白的表达水平等方面差异均有显著性意义(P<0.05);各治疗组与安慰剂组比较各项指标均有不同程度的改善,各组间比较差异均有显著性意义(P<0.05);治疗组间比较显示,联合组大鼠前列腺组织炎症程度较其他三组明显减轻,且IL-1β/TNFα及MIF的表达水平也明显降低,两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 清浊祛毒丸联合针刺对实验性大鼠慢性非细菌性前列腺炎有明显的治疗作用,可减轻前列腺炎症程度,降低炎性细胞因子的表达,是治疗慢性非细菌性前列腺炎的一种可行方法。
清浊祛毒丸; 针刺; 前列腺炎; 大鼠
慢性前列腺炎是泌尿男科门诊常见疾病之一,因其症状多变、病因复杂导致治疗效果欠佳。目前临床尚缺乏针对该病的特效治疗药物。本研究拟采用慢性非细菌性前列腺炎动物模型,验证清浊祛毒丸联合针刺治疗慢性非细菌性前列腺炎的效果;通过检测前列腺液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度变化及前列腺组织中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达情况,探讨清浊祛毒丸联合针刺治疗慢性非细菌性前列腺炎的可能分子机制,阐明慢性非细菌性前列腺炎的发病机制,为临床治疗慢性非细菌性前列腺炎提供新的治疗方法。
一、动物与分组
选择10月龄健康雄性Wistar大鼠72只,体质量250~300g,由广东省实验动物中心提供。常规饲养7d后,随机分为6组:(1)正常对照组;(2)安慰剂组;(3)西药对照组 ;(4)中药治疗组;(5)针刺治疗组;(6)中药+针刺联合治疗组(简称联合治疗组),每组12只。6组大鼠均常规饲养,统一取材。
二、动物模型的制备与验证
造模方法参考文献[1],选择10月龄Wistar大鼠常规饲养,在乙醚麻醉下行手术去势。术后第1天大鼠后背部皮下注射17β-E20. 25 mg/2 ml•kg-1,用芝麻油稀释,连续30 d注射诱导,成功建立CNP大鼠模型。正常对照组皮下注射生理盐水0.6mL。第31天时每组处死2只,取前列腺病理检查,观察到前列腺局部组织结构损害,部分基膜被破坏,出现明显炎性细胞浸润的慢性炎症病理改变,可判定造模成功。
三、药物制备及给药处理
清浊祛毒丸(广西玉林大清药业有限责任公司生产,批准文号:国药准字Z20025347,生产批号为0810171,规格8g/包,8g×6包/盒)由金沙藤、大血藤、蒲公英、牡丹皮、虎杖、益母草等药物组成(,根据人-大鼠体质量比计算确定中药实验组(中药治疗组、联合治疗组)给予生药量0.48g/kg体重剂量灌胃。西药对照组给予哈乐0.2mg+西乐葆0.2g,临用时将药捣碎,生理盐水溶解稀释成4.004 mg/kg体重剂量灌胃,qd。造模30 d后开始给药,安慰剂组及正常对照组用生理盐水灌胃。
于造模的第31天起,针刺治疗组及联合治疗组与药物治疗同时开始进行针刺治疗。针具:0.40mm×15mm华佗牌无菌针灸针。取穴:关元、中极、三阴交(双侧)、肾俞穴(双侧)、会阳穴(双侧)。穴位定位主要参照林文注主编的《实验针灸学》[2]。 针刺方法:针刺治疗组、联合治疗组各鼠每日均抓取、捆绑一次(30min/次);穴位及针具用75%酒精消毒,选用0.40mm×15mm毫针,肾俞斜刺向脊柱方向6mm,会阳稍向内前斜刺6mm,关元、中极直刺3mm,三阴交直刺3mm,行捻转针法,频率100次/min,捻转角度90°~120°,每次捻转3min,每隔10min捻转1次,留针30min后出针。qd,5d为1个疗程,疗程间休息2d,共进行4个疗程。各组同时给药及治疗30 d后处死。
四、标本取材
末次给药及治疗后24 h处死大鼠,剥离前列腺并称重,1 /3组织经匀浆后,提取总蛋白,其余2 /3组织入甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色。
五、光镜观察
将已固定好的前列腺组织从10%甲醛溶液中取出,石蜡切片,切片厚度5μm,常规苏木素-伊红(HE)染色,显微镜观察。在200×光镜下,每张切片观察3个视野,按病变程度不同分为-、+/-、+、++、+++,无病变者为-,轻微病变者为±,病变占1/3者为+,占3/4为+++,两者之间为++。
六、ELISA法检测前列腺液中IL-1β/TNFα的表达水平
末次给药后24h,剖取大鼠前列腺组织,部分腺体按1ml/100mg加生理盐水作组织匀浆,离心后取上清液按ELISA法测定前列腺液中IL-1β/TNFα的表达水平。
七、Western blot 检测MIF蛋白的表达
末次给药后次日,剖取大鼠前列腺组织,经匀浆后用蛋白提取液提取蛋白,用预冷的PBS洗2次,去上清,加4×SDS凝胶上样缓冲液,沸水浴变性10min。常规制备SDS-PAGE凝胶,按分组点两组相同样品,120V电泳约3.5h后,切下其中一组按常规方法固定、考马斯亮蓝R-250染色和脱色,作为判断Western blot的依据。另一组样品切胶转膜,硝酸纤维素膜按凝胶大小剪裁,并头尾做好标记,两侧各置滤纸3张,按胶负膜正放置,4℃、18V转膜过夜。取出膜,用封闭液封闭至少2h,TBS液洗膜3次,每次10min;加入1:100稀释的一抗,4℃作用2h;TBS液洗膜3次,每次10min;加入1:5000稀释的羊抗兔IgG二抗,室温作用1h;TBS液洗膜3次,每次10min;用反射显影技术观察条带。用Gel Logia 200成像系统摄像并分析。
八、药物安全性评估
实验大鼠分别于实验前后检测以下项目:(1)一般体检项目;(2)血、尿、便常规化验;(3)肝、肾功能检查,以评估实验对大鼠躯体的影响。
九、统计分析
一、动物模型制备情况
实验大鼠常规饲养。模型组大鼠术后加强保暖,12 h 后自由饮水,每天两次碘伏消毒切口,防止感染。于造模后第31天时每组处死2只大鼠,取前列腺组织行病理检查, 200倍光镜下观察,可见模型组大鼠前列腺间质结缔组织明显增生水肿, 血管增生充血,间质及血管内可见大量淋巴细胞及浆细胞浸润,部分基膜被破坏,腺腔内可见大量渗出物及淋巴细胞,出现明显慢性炎症病理改变,证实造模成功。正常对照组大鼠前列腺腺上皮细胞多排列规整,呈柱状排列,腺腔形态不一,腺组织呈较规则的圆形或椭圆形,间质及血管内无炎性细胞浸润或水肿。
二、实验大鼠前列腺组织中炎症程度比较
各组大鼠前列腺组织中炎症程度分布情况如表1所示。统计学分析显示,安慰剂组与正常对照组、西药组、中药组、针刺组及联合组比较前列腺组织中炎症程度差异有统计学意义(x2=33.751,P=0.031<0.05);西药组、中药组、针刺组及联合组前列腺炎症较安慰剂组明显减轻,前后两两比较差异均有统计学意义(x2=9.614,P=0.047<0.05;x2=9.823,P=0.041<0.05;x2=9.556,P=0.048<0.05;x2=10.973,P =0.028<0.05);联合组与西药组、中药组及针刺组比较统计学差异均有显著性意义(x2=14.967,P=0.004<0.01;x2=12.173,P=0.021<0.05; x2=11.014,P=0.027<0.05),见表1。
表1 实验大鼠前列腺组织中炎症程度比较 (n/%)
三、大鼠前列腺液中IL-1β/TNF-α的表达水平
各组大鼠前列腺液中IL-1β/TNF-α的表达水平变化情况如表2所示。统计学分析显示,六组大鼠前列腺液中IL-1β、TNF-α的表达水平均有统计学差异(F=3.526,P=0.032<0.05;F=4.281,P=0.026<0.05);安慰剂组IL-1β、TNF-α的表达水平与正常对照组相比出现明显升高,差异有显著性意义(t=3.742,P=0.001<0.01;t=2.954,P=0.007<0.01);西药组、中药组、针刺组及联合组与安慰剂组比较均出现不同程度降低,差异均有统计学意义(t=2.253,P=0.041<0.05;t=2.347,P=0.032<0.05;t=2.715,P=0.019<0.05;t=2.938,P=0.008<0.01);而联合组与西药组、中药组及针刺组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。
四、大鼠前列腺组织中MIF蛋白的表达情况
各组大鼠前列腺组织中MIF的表达变化情况如图1所示。统计分析显示,6组大鼠前列腺组织中MIF的表达水平有统计学差异(F=4.372,P=0.023<0.05);安慰剂组MIF的表达水平与正常对照组相比出现明显升高,差异有显著性意义(t=3.836,P=0.001<0.01);西药组、中药组、针刺组及联合组与安慰剂组比较均出现不同程度降低,差异均有统计学意义(t=2.298,P=0.039<0.05;t=2.348,P=0.030<0.05;t=2.823,P=0.015<0.05;t=3.889,P=0.009<0.01);而联合组与西药组、中药组及针刺组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。
五、药物安全性评估
实验各组大鼠用药前后检测血、尿及大便常规、心电图、肝肾功能均未见异常。60例大鼠中均未出现严重不良反应。出现轻度不良反应共13例,其中西药组有1例出现食欲不振,有2例轻度腹泻;中药组有2例出现食欲不振,4例轻度腹泻;针刺组未见明显不良反应,1例出现皮下血肿;联合组有2例轻度腹泻。
表2 实验大鼠前列腺液中IL-1β/TNF-α的表达变化(s)
表2 实验大鼠前列腺液中IL-1β/TNF-α的表达变化(s)
与其他五组比较,#P<0.05;与安慰剂组比较,△P<0.05;与联合组比较,★P<0.05
组别 n IL-1β TNF-α(ρ/pg•mL-1) (ρ/pg•mL-1)正常组 10 78.14±46.27 81.43±13.21安慰剂组 10 456.25±67.53# 387.14±62.45#西药组 10 347.53±55.42△★ 218.45±25.54△★中药组 10 159.38±19.18△★ 172.78±45.62△★针刺组 10 134.29±14.56△★ 148.34±24.38△★联合组 10 79.58±25.89△ 121.52±17.52△
图1 各组MIF蛋白表达比较与其他五组比较, #P<0.05;同安慰剂组比较, △P<0.05; 与联合组比较, ★P<0.05
慢性前列腺炎的病因学十分复杂,尽管对其众多的发病机制有了相当程度的认识,但均没有突破性进展。近年来研究发现,前列腺炎患者前列腺液中常常可以出现某些细胞因子水平的变化,例如白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-8、IL-10等[3-5],且其表达与症状及治疗反应均有一定的相关性,表明免疫反应参与了慢性前列腺炎的发病机制。
目前研究显示,免疫反应在慢性前列腺炎的发病过程中起重要作用。在此过程中细胞因子起介导作用,主要通过免疫细胞自分泌或旁分泌方式完成其功能,同时参与复杂的细胞因子网络调节作用。机体在病原生物或其他抗原刺激下,巨噬细胞被激活,一方面巨噬细胞产生大量的促炎性细胞因子,如TNF-α、IL-6、MIF 等,另一方面巨噬细胞将抗原呈递给T 细胞,激活T 细胞,产生大量细胞因子,使免疫反应进一步扩大。MIF 可促进巨噬细胞的活化,从而形成正性反馈环路,并可通过多种途径完成炎症细胞的招募,促进IL-6、IL-1β、TNF-α 、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等一系列炎性因子的释放,同时拮抗抗炎物质(如糖皮质激素)的作用。IL-6、IL-1β、TNF-α 、MCP-1等作为促炎因子,可以诱导中性粒细胞和单核细胞向炎症部位聚集和调节白细胞黏附分子的表达, 诱导局部炎症反应中白细胞的趋化活性, 引起局部组织炎症和损伤并导致疼痛,从而产生前列腺炎的各种临床症状[6]。
中医中药是中华民族的灿烂瑰宝,对治疗慢性非细菌性前列腺炎也有其独特的疗效。临床研究显示,清浊祛毒丸能明显改善患者临床症状,降低临床总有效率为86.7%[7]。研究还表明,清浊祛毒丸可通过减少前列腺液中白细胞数量,增加卵磷脂小体密度, 降低前列腺组织中IgG表达,减轻前列腺腺体的炎症反应,促进前列腺生理功能的恢复,对实验性急性细菌性前列腺炎及慢性非细菌性前列腺炎均有抑制作用[8]。针刺对慢性非细菌性前列腺炎也有明显治疗效果。最新研究显示,针刺能调节慢性非细菌性前列腺炎患者TNF-α、IL-1β 水平,减轻炎性细胞的趋化,从而缓解前列腺炎所致的会阴部不适,对治疗慢性非细菌性前列腺炎有明确疗效[9]。清浊祛毒丸联合针刺治疗慢性非细菌性前列腺炎尚未见报道。因此,本研究采用中成药制剂清浊祛毒丸联合针刺治疗慢性非细菌性前列腺炎,观察其治疗效果并探讨慢性非细菌性前列腺炎的可能发病机制。
本研究采用清浊祛毒丸联合针刺治疗实验性大鼠慢性非细菌性前列腺炎,观察大鼠前列腺组织中炎症变化情况,并通过检测前列腺液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度变化及前列腺组织中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达情况,探讨清浊祛毒丸联合针刺治疗慢性非细菌性前列腺炎的可能分子机制。本研究发现,清浊祛毒丸联合针刺可明显改善实验大鼠前列腺组织的炎症程度。研究还发现,清浊祛毒丸联合针刺治疗实验性大鼠慢性非细菌性前列腺炎可明显降低患者前列腺液中IL-1β、TNF-α及MIF的表达水平,提示清浊祛毒丸及针刺治疗可能通过调节前列腺组织中IL-1β、TNF-α及MIF的表达水平,从而改善大鼠前列腺组织的炎症程度。这与国内叶刚、朱爱茹等[10,11]研究结果相似。
本研究证实清浊祛毒丸联合针刺可明显改善慢性非细菌性前列腺炎大鼠前列腺组织的炎症程度,且安全性好,无明显毒副作用,是治疗慢性非细菌性前列腺炎的一种比较理想的方法。尽管清浊祛毒丸及针刺治疗单独应用治疗慢性前列腺炎均显示一定的治疗效果,但联合治疗疗效更佳,且不良反应未见明显增加。本研究将为临床治疗慢性非细菌性前列腺炎提供一种新的治疗方法及理论依据,尚需进一步临床试验以证实本研究结论。
1 Kamijo T, Sato S, Kitamura T. Effect of cernitin pollenextract on experimental nonbacterial prostatitis in rats. Prostate 2001; 49(2): 122-131
2 林文注, 王佩主编.《实验针灸学》第2版. 上海:上海科学技术出版社, 1999: 284-288, 183-187
3 Nadler RB, Koch AE, Calhoun EA, et al. IL-1beta and TNF-alpha in prostatic ecretions are indicators in the evaluation of men with chronic prostatitis. J Urol 2000;164(1): 214-218
4 La Vignera S, Calogero AE, Castiglione R, et al. IL-6,TNF-alfa, IL-10 in the seminal plasma of patients with bacterial male accessory gland infections after sequential therapy. Minerva Urol Nefrol 2008; 60(3): 141-145
5 贺大林, 周锋, 何辉, 等. 前列腺按摩液中IL-8 和TNF-α测定在慢性前列腺炎诊断、分型中的临床意义. 中华男科学杂志 2004; 10(10): 740-742
6 Haverkamp JM, Charbonneau B, Crist SA, et al. An inducible model of abacterial prostatitis induces antigen specifi c infi ammatory and proliferative changes in the murine prostate. Prostate 2011; 71(11): 1139-1150
7 韦品清, 刘成柱. 清浊祛毒丸治疗湿热型前列腺炎的临床观察. 现代中西医结合杂志 2002; 11(8): 691- 692
8 韦品清, 刘成柱, 李小翠. 清浊祛毒丸对急慢性前列腺炎抗炎作用的实验研究. 新中医 2002; 34(5): 74-75
9 亓兴亮, 潘付堂, 吴卫志. 针刺对慢性非细菌性前列腺炎细胞因子的影响. 山东中医杂志 2012; 31(6): 418-420
10 叶刚, 池建平, 李英伦. 针刺对慢性前列腺炎大鼠组织学及血清中TNF-α 和IL-6 的影响. 中国老年学杂志2014; 34(3): 1330- 1331
11 朱爱茹, 亓兴亮. 针刺对慢性非细菌性前列腺炎前列腺液中IL-1β的影响. 山东中医药大学学报 2007; 31(5) : 397-398
(2015-09-05收稿)
The effects of Qingzhuo Qudu Wan combined with acupuncture on experimental rats with chronic nonbacterial prostatitis*
Li Shilin1**, Tang Liang2, Ye Haixia3, Pu Xiaoyong4, Wang Huaipeng4
1. Department of Urology, Nansha Hospital of Guangzhou First people's Hospital, Guangzhou 511457, China; 2. Department of Traditional Chinese Medicine, Nansha Hospital of Guangzhou First People's Hospital; 3. Department of Neurology,Nansha Hospital of Guangzhou First People's Hospital; Department of Urology, Guangdong Provincial People's Hospital
Corresponding author: Li Shilin, E-mail: Androstar2008@163.com
Objective To investigate the effects of Qingzhuo Qudu Wan combined with acupuncture on experimental rats with chronic nonbacterial prostatitis (CNP) and discuss its molecular mechanisms. Methods Total of 72 10-month-old healthy male Wistar rats were randomly divided into the control group, the placebo group, western medicine group, TCM group, acupuncture group and combined treatment group (combined group), each group 12 rats. Rat model with CNP was induced by castration and injecting 17β-estradiol (17β-E2) production into subcutaneous of rats' back. After the models were successfully made, rats in the normal control group and the placebo group
saline treatment, rats in the other groups were treated with tamsulosin and celecoxib capsules, Qingzhuo Qudu Wan, acupuncture, Qingzhuo Qudu Wan plus acupuncture respectively. Treatment period was 30 days. After treatment, the rats were sacrificed and the lesions of rat prostate tissue were observed under a microscope, the expression levels of IL-1β/ TNF-α in prostatic fi uid were detected by ELISA and the expression levels of MIF in prostate tissue were detected by Western Blot. The differences of indexes among groups were analyzed by statistical analysis. Results The models were successfully established in each group. There were signifi cant differences in prostate tissue infi ammation, level of prostatic fi uid IL-1β/TNF-α or expression of MIF in prostate tissue among six groups (P<0.05); Compared with those of the placebo group, all indexes in each treatment group were all improved in varying degrees, differences among groups were statistically signifi cant (P<0.05); Compared with that of the other three groups among the treatment groups, rat prostate tissue infi ammation of the combined group was signifi cantly decreased, and the expression level of IL-1β / TNF-α/ MIF was signifi cantly reduced, differences among the two groups were statistically signifi cant (P<0.05). Conclusion Qingzhuo Qudu Wan combined with acupuncture has obvious therapeutic effects on experimental rats with chronic bacterial prostatitis, it can lessen prostatitis extent, reduce the expression of infi ammatory cytokines; it may be a possible ways in the treatment of chronic non-bacterial prostatitis.
Qingzhuo Qudu Wan; acupuncture; prostatitis; rats
10.3969/j.issn.1008-0848.2015.11.008
R 697.33
资助: 广东省中医药管理局中医药课题项目(N0.20132002)
**通讯作者, E-mail: Androstar2008@163.com