热应激诱导雄性大鼠生殖功能改变的实验观察*

高俊涛 万 朋 王春艳 谢 维

吉林医药学院生理学教研室（吉林 132013）

热应激诱导雄性大鼠生殖功能改变的实验观察*

高俊涛**万 朋 王春艳 谢 维

吉林医药学院生理学教研室（吉林 132013）

目的 观察热应激诱导雄性大鼠生殖功能的改变，并初步探讨其生理机制。方法 清洁级Wistar大鼠64只，随机分成4组，即正常对照组及环境温度分别为38℃、40℃、42℃的3组热应激组，将大鼠暴露于高温环境1h/d，连续14d。分别于高温暴露后7d 和14d进行大鼠性行为能力的观察，包括扑捉潜伏期（capture incubation period，CIP）、扑捉次数（capture times，CT）、精子相对计数、精子畸形率；血清与睾丸组织中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等指标的检测。结果 与正常对照组比较，42℃高温暴露7d，14d以及40℃高温暴露14d后大鼠的扑捉潜伏期显著延长，扑捉次数显著减少（P＜0.05）；精子相对计数明显减少（P＜0.05）；精子畸形率明显增加（P＜0.05）；血清和睾丸组织中SOD的活性显著降低（P＜0.05），MDA的含量显著增加（P＜0.05）；38℃热应激组上述各项指标与正常对照组相比均未见明显变化。结论 高温环境暴露后，产生的热应激可改变雄性大鼠的生殖功能，其作用机制可能与生殖细胞的氧化损伤有关。

热应激； 生殖细胞； 氧化性应激

高温环境导致人体体温调节中枢功能紊乱，体核温度升高，并由此引起循环系统与中枢神经系统功能障碍，表现为高体温、谵妄、惊厥或昏迷［1］。机体处于高温环境，机体体温调节失败，最终机体出现动脉血压降低，氧分压降低，如无法得到及时抢救将导致血压迅速下降，机体各器官缺血缺氧，直至死亡。高温环境对人类健康和生殖功能产生危害，当前各国生殖健康的状况相当严峻，高温对睾丸组织会产生损害，精子对高温环境特别敏感，使男性生殖能力下降，甚至导致不孕不育症。以往的研究表明，热应激与雄性生殖功能存在密切的联系，热应激导致精子发育异常［2］，热应激诱导蛋白-1在雄性生殖系统的表达［3］，热应激引起的代谢改变与雄性生殖功能具有密切联系［4］，因此，本实验采用不同温度的热应激动物模型，在大鼠的生精期内，选取不同的时间点，分别从大鼠性行为能力和血清及组织中氧化应激水平等方面来研究不同温度对雄性大鼠生殖系统的时间毒性，探讨热应激引起雄性大鼠生殖功能的改变及其机制，为高温环境对生殖系统的影响提供理论依据。

材料与方法

一、实验动物分组

选择清洁级Wistar大鼠（吉林大学白求恩医学部实验动物中心）64只，雄性，体质量（180±20）g，适应性饲养1周，室温（22±2）℃，相对湿度40%～60%，由吉林大学动物实验中心提供。实验动物随机分为4个组，即正常对照组和热仓内温度38℃、40℃、42℃的3个热应激组，分别设为低、中、高温度组，每组16只。

二、仪器与试剂

DKB-501S型超级恒温水浴（上海精宏实验设备有限公司），Hitachi 7600生化分析仪（日本Tokyo公司），多通道生理记录仪（美国BiopacMP150）；ZMN-7803型全自动组织包埋机（常州市华利电子有限公司），RM2126型轮转式切片机（上海徕卡仪器有限公司），BA300型数码生物显微镜（中国麦克奥迪实业集团有限公司），酶标仪（SUNRISE），TD5A 型台式低速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；SOD和MDA检测试剂盒均购置于南京建成生物技术研究所（批号：20150625）。

三、大鼠热应激模型制备

使用超级恒温水浴，连接有机玻璃夹层水循环舱，保持室温为23.0～24.0℃，控制水温，保持热循环舱实测温度为38℃、40℃、42℃，相对湿度40%～60%，风速0～0.2m/s，稳定l h以上。将大鼠置于大小合适固定器中，放入温度分别为38℃、40℃、42℃热仓内，1h/d，连续14d，实时监测热仓内温度，使仓内温度保持稳定，控制入仓时间，对照组除不接受热应激外，其它处理与热应激组相同。

四、相关指标的检测

（一）性行为能力的观察

分别于热应激7d和14d，参照Agmo［5］方法进行，在安静的室内分别将每组的每只雄性大鼠放置于50cm×35cm×20cm的干净的大鼠笼中适应5min，随后投入到同批饲养的正常雌性大鼠形成1对1的配对，观察30min。观察放置雌性大鼠后，雄性大鼠的第一次扑捉时间即扑捉潜伏期，同时观察雄性大鼠在30min内对雌性大鼠的扑捉次数。

（二）精子相对计数测定

分别于热应激7d和14d后，大鼠脱椎处死后，取出双侧附睾，在盛有2mL生理盐水（提前预热至37℃）的洁净培养皿中进行剥离术，使储存在附睾中的精子游离出来。剥离好的附睾放置于37℃的恒温箱中孵育15～20min，取出过滤（4层滤纸）至EP试管。用移液枪取出100μL的精液，加入3%100μL的NaCl溶液中固定，轻轻混匀后取适量滴加至红细胞计数板中，在显微镜下计数精子数。计数原则：对于压线精子，只计数精子头，数上不数下，数左不数右。视精子密度而定，若精子密度高，则取1滴精液涂片即可。涂好的涂片自然风干，待其干燥后，加入适量甲醇固定，待其干燥后，置于2%的伊红染液中染色1h，染好后取出，以细小流水轻轻冲洗，自然干燥后即可在显微镜下观察。在低倍显微镜下找到背景清晰精子重叠较少的部位。用高倍显微镜顺序检查精子形态，每只大鼠检查完整的精子500条。

（三）血清和睾丸组织SOD和MDA检测

分别于热应激的7d和14d后，经大鼠腹主动脉取血，将血液置于肝素处理过的冰浴试管内，将睾丸组织切碎匀浆，分别置于3 000×g的离心机内离心30min，分别取血清和上清液，进行氧化损伤指标的检测，SOD和MDA试剂盒均购置于南京建成生物技术研究所，严格按照相应试剂盒说明进行操作。

（四）数据处理和统计学分析

结 果

一、热应激对雄性大鼠性行为的影响

正常雄性大鼠放置于雌性大鼠后（29.37±3.65）s开始扑捉，在30 min内扑捉雌鼠的次数可达（41.28±5.16）次；42℃热应激7d后，雄性大鼠表现为少动，扑捉潜伏期明显延长至（40.20±5.31）s，在30 min内扑捉的次数也显著减少至（29.38±3.81）次，与正常对照组比差异异均具统计学意义（P＜0.05）；42℃热应激14d后大鼠的扑捉潜伏期显著延长、扑捉次数显著减少，与正常对照组比差异异均具统计学意义（P＜0.05），（见表1）。

二、热应激对雄性大鼠精子质量的影响

分别于热暴露的7d和14d后，取出双侧附睾，观察热应激组大鼠与正常对照组大鼠的精子数量及精子的致畸率变化，结果显示，高温度组7d、14d后和中温度组14d后精子相对计数明显减少，精子畸形率明显增加（P＜0.05），差异均具统计学意义。（见表2）。

表1 热应激7 d和14 d后对雄性大鼠性行为的影响（n=8）

表2 热应激7 d和14 d后对雄性大鼠精子质量的影响（n=8）

三、热应激对雄性大鼠组织和血清中SOD活性和MDA含量的影响

分别于热应激的7d和14d后，经大鼠腹主动脉取血并收集血清，将睾丸组织切碎匀浆取上清液，取待测样本严格按照试剂盒说明进行操作，高温组7d、14d后和中温度组14d后与正常对照组相比，血清和睾丸组织中SOD的活性显著降低（见图1），血清和睾丸组织中MDA的含量显著增加（P＜0.05），差异均具统计学意义（见图2）。

图1 热应激后7d和14d对大鼠血清和睾丸组织中的SOD活性的影响图2A为热应激后7d和14大鼠血清中SOD活性的变化；图1B为热应激后7d和14d大鼠睾丸组织中SOD活性的变化；C：正常对照组，L：低温度组，M：中温度组，H：高温度组；与正常对照组相比较，*：P＜0.05， **：P＜0.01

图2 热应激后7d和14d对大鼠血清和睾丸组织中的MDA含量的影响图2A为热应激后7d和14d大鼠血清中MDA含量的变化，图2B为热应激后7d和14d大鼠睾丸组织中MDA含量的变化；C：正常对照组，L：低温度组，M：中温度组，H：高温度组； 与正常对照组相比较，*：P＜0.05， **：P＜0.01

讨 论

雄性生殖系统对温度变化敏感，热应激对雄性生殖系统产生不良的影响，由于睾丸中血管相对缺乏，血流不畅，散热困难，所以易出现过热而造成睾丸损伤。研究表明，短时间的热应激可引起雄性大鼠可逆性的睾丸损伤［6］。本研究表明，持续高温环境可引起精子活力下降，存活率降低，畸形率增加等。有研究表明热应激能够引起代谢改变，从而影响雄性生殖系统［4］。热应激过程中睾丸和生精细胞产生过氧化物、一氧化氮等活性氧族（ROS）和活性氮族物质（RNS）［7］，它们与精子的生理功能有关。当ROS的产生超过生殖系统抗氧化系统的清除能力时，精子受活性氧的过氧化伤害则会对精子产生毒性作用，引起精子膜脂质过氧化，导致其形态、功能及代谢异常，甚至导致雄性不育。丙二醛（MDA）是过氧化脂质的分解产物，通过MDA的测定可反应体内自由基产生的程度。超氧化物歧化酶（SOD）是细胞中主要的抗氧化酶之一，它在机体清除氧自由基（ROS）的过程中起着关键作用。本实验结果表明，本研究分别在热应激的第7天和第14天，进行了大鼠的性行为观察，并完成了精子相对计数和精子畸形率的分析，同时测定了睾丸组织和血清中SOD的活性以及MDA的含量，实验结果提示，高温环境暴露的过程中热应激可以随时间和强度聚集，导致精子的相对数量减少而精子的畸形率增加，热应激模型组大鼠血清和睾丸组织内MDA含量均较正常对照组高，而热应激模型组大鼠血清和睾丸组织内SOD水平显著下降。这些结果提示，热应激对雄性大鼠生殖系统的影响，其作用机制可能与生殖细胞的氧化损伤有关。

1 Bouchama A， Knochel JP， Heat stroke. N Engl J Med 2002； 346 （25）: 1978-1988

2 Kurowicka B， Dietrich GJ， Kotwica G. Effect of neonatal or adult heat acclimation on testicular and epididymal morphometry and sperm production in rats. Reprod Biol 2015； 15（1）: 1-8

3 Wang Y， Jin S， Li N， et al. Systematic study of stressinducible protein 1 （Stip1） in male reproductive system and its expression during stress response. Gene 2015；554（1）: 58-63

4 Hou Y， Wang X， Lei Z， et al. Heat-stress-induced metabolic changes and altered male reproductive function. J Proteome Res 2015； 14（3）: 1495-1503

5 Agmo A. Male rat sexual behavior. Brain Res Brain Res Protoc 1997； 1（2）: 203-209

6 Tenorio BM， Ferreira Filho MB， Jimenez GC， et al. Extremely low-frequency magnetic fields can impair spermatogenesis recovery after reversible testicular damage induced by heat. Electromagn Biol Med 2014；33（2）: 139-146

7 Pino JA， Osses N， Oyarzún D， et al. Differential effects of temperature on reactive oxygen/nitrogen species production in rat pachytene spermatocytes and round spermatids. Reproduction 2013； 145（2）: 203-212

（2015-08-28收稿）

Heat-stress-induced male reproductive function changes in rats*

Gao Juntao**， Wan Peng， Wang Chunyan， Xie Wei
Department of Physiology， Jilin Medical College， Jilin 132013， China
Corresponding author: Gao Juntao， E-mail: 15948628662@163.com

Objective To investigate the heat-stress-induced male reproductive function changes in rats and exploreits mechanism. Methods Total of 64 male wistar rats with clean degree were randomly divided into the control group and the heat stress groups with 38℃， 40℃， 42℃. Heat exposure （1h/d） lasted for 14 d. Sex ability of rats was assessed including the capture incubation period （CIP） and the capture time （CT）. After heat exposure， the number of sperm count and sperm deformity， the superoxide dismutase （SOD）， and malondialdehyde （MDA） were detected. Results Under 42℃ heat exposure， capture incubation period （CIP） of rat was prolonged and the capture time （CT） was reduced signifi cantly （P＜0.05）on 7d， 14d and under 40℃ heat exposure on 14d. Under 42℃ heat exposure， relative sperm count and the activity of SOD in serum and testicular tissue were decreased signifi cantly （P＜0.05）， whereas sperm malformation rate and the content of MDA in serum and testicular tissue were increased signifi cantly （P＜0.05） on 7d， 14d and under 40℃ heat exposure on 14d.. All the above-mentioned indexes had no signifi cant changes compared with those of the control group. Conclusion Heat stress can affect male reproductive system， and its mechanism may be related to the oxidative damage of germ cells.

heat； germ cells； oxidative stress

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.11.004

R 691.6

资助: 国家自然科学基金（31071042）； 吉林省卫生厅科学技术研究项目（2012Z066）

**通讯作者: E-mail: 15948628662@163.com