金铃子散抗炎有效部位筛选及质谱表征

戴 一，贾晓益，王海菲



金铃子散抗炎有效部位筛选及质谱表征

*戴 一，贾晓益，王海菲

（安徽新华学院药学院，安徽，合肥 230088）

目的筛选金铃子散的抗炎有效部位并对有效部位进行质谱(MS)表征。方法 将金铃子散采用梯度极性溶剂石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超声提取，提取物通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验以确定抗炎有效部位，并对抗炎有效部位采用MS进行初步表征。结果 金铃子散石油醚提取物对小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用，MS分析其特征离子峰为m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.5、366.4。结论 金铃子散石油醚提取物具有明显的抗炎作用，为金铃子散的抗炎有效部位。

金铃子散; 有效部位; 抗炎；质谱

炎症是常见且重要的病理过程，体表外伤感染及器官病变如肝炎、肾炎、肺炎等都属于炎症性疾病，炎症局部表现为红、肿、热、痛。治疗炎症的药物有糖皮质激素类及非甾体抗炎药物，尽管表现出了显著的抗炎疗效，但存在一定的副作用[1-2]，抗炎药物有待进一步开发。金铃子散出自《素问·病机气宜保命集》，延胡索、金铃子两味药为其组成成分，两药配伍比例为1:1，以延胡索活血行气；川楝子泄肝火、疏肝行气，二药相配，一温一寒，一血一气，配伍后能活血散淤、行气镇痛，为治疗胸痛、脘腹疼痛的常用药方[3]。有研究报道延胡索乙素为延胡索的抗炎成分[4]，而金铃子散药效物质基础研究并不深入，对于金铃子散的研究主要集中在延胡索和金铃子二味药材的配伍比例，且抗炎的研究对象主要为金铃子散的水提物[5-7]，目前尚未见其抗炎有效部位的研究报告。二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型不需要特殊设备且快速，它是天然药物抗炎药研究中最常用的炎症模型[8]。为了提高金铃子散在传统用药中的疗效，本研究将金铃子散分别用石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超声提取，通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验，初步筛选抗炎有效部位；并对有效部位采用质谱(MS)进行分析，为科学开发金铃子散的药理作用提供可靠的实验依据。

1 材料

1.1 动物

健康昆明种小鼠，雄性，体重20 ± 2 g，由安徽医科大学实验动物中心提供(合格证号：皖医实动准字第01号)。在恒温(22℃)，光照周期12 h: 12 h环境中饲养。

1.2 药物与试剂

金铃子散自制（川楝子、延胡索购于亳州药材市场）；阿司匹林（湖北鸿运隆生物科技有限公司）；石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、二甲苯等均为分析纯。

1.3 仪器

API3000质谱仪（美国应用生物系统公司），FA2004型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），8510E-DTH超声提取器（美国必能信公司），旋转蒸发器RE-3000(上海亚荣生化仪器厂)，DZF-6020型真空干燥箱（上海三发科学仪器有限公司），打孔器。

2 方法

2.1 各极性段样品的制备

称取10 g金铃子散，6份，分别用10倍量的石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超声提取，每次提取30 min，每组溶剂提取3次，每组提取液合并，浓缩至干，称重，以0.5%的CMC-Na及蒸馏水转移至50 mL容量瓶备用。

2.2 分组及给药

动物随机分为8组，依次为：模型组、石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超声提取组、阿司匹林组。金铃子散：各组给药剂量按照临床公斤体重用药量折算，小鼠每10 g体重给药0.2 mL/d，含药量相当于0.2 g生药；阿司匹林对照组，小鼠给药量(100 mg·kg-1)。

2.3 二甲苯诱导小鼠耳肿胀模型的制备与检测

取昆明种小鼠80 只，体重18~22 g，雌雄各半，随机分为8 组，每组10 只，即生理盐水组、阿司匹林组、石油醚提取物组、四氯化碳提取物组、三氯甲烷提取物组、乙酸乙酯提取物组、甲醇提取物组及水提取物组编号，称重，灌胃给药，1 次/d，连续给药4 d，生理盐水组给生理盐水20 mL /kg，阿司匹林组给阿司匹林，给药量0.1 g /kg，给药组按20 g /kg 灌胃给药。给药后1.5 h，将二甲苯0.05 mL均匀涂于小鼠右耳，30 min 后处死，用7 mm打孔器分别打下左右耳片，以左右耳重量之差作为肿胀度，计算肿胀抑制率，肿胀抑制率( %) =(对照组平均肿胀度－给药组平均肿胀度) /对照组平均肿胀度× 100%。比较给药组与模型组之间小鼠耳片肿胀度的差异显著性[7]。

2.4 统计处理

2.5 有效部位类别鉴定

对金铃子散石油醚提取物进行质谱分析，质谱条件为：ESI正离子扫描模式，全扫描范围M/Z 50-1000，NEB: 7.00、CUR: 8.00、IS: 5500.00、TEM: 350.00、DP 30.00、FP 200.00。

3 结果

3.1 金铃子散各提取组分对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响

将金铃子散分别用石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超声提取的组分进行二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验，结果表明，金铃子散石油醚、水、甲醇提取的组分均能抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀，其中，石油醚超声提取组与模型对照组相比，有显著性差异（< 0.01），与阿司匹林阳性对照组对比无统计学意义。因此，确定石油醚超声提取组分为金铃子散抗炎有效部位。

表1 金铃子散各提取组对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响(± s, n = 10)

Table 1 The results of the model of pinna swilling resulted by dimethyl benzenel with different extract fractions of Jinlingzisan

表1 金铃子散各提取组对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响(± s, n = 10)

分组剂量(g·kg-1)肿胀度(Δ mg)抑制率 (%) 模型组－9.77 ± 3.54－ 石油醚提取组202.12 ± 1.47**78.33 四氯化碳组206.43 ± 1.4631.13 三氯甲烷提取组207.32 ± 1.7725.09 乙酸乙酯提取组206.83 ± 3.6530.04 甲醇提取组204.78 ± 2.68*51.03 水提取组205.55 ± 2.96*43.14 阿司匹林组0.13.95 ± 2.51**59.56

与模型组比较*< 0.05,**< 0.01

3.2 有效部位质谱MS分析结果

抗炎实验结果表明金铃子散石油醚组分具有较强的抗炎作用，ESI-MS分析结果表明其抗炎有效部位主要主要在m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.6、330.6、366.4具有较强的特征离子峰，参考文献[9-11]，仅能对其中的4个峰进行归属m/z279.4与亚油酸分子离子峰一致、m/z301.6与高北美圣草素分子离子峰一致、m/z330.6与豆甾烷-3,5-二烯分子离子峰一致、m/z366.4与去氢紫堇碱分子离子峰一致。另外在m/z400以下，离子峰比较密集且强度不大，可能所含成分类型较多且含量不高，结合提取溶剂为石油醚，因此成分应属于挥发油类[10]，其抗炎活性可能为多成分综合作用结果，但其表现的质谱特征可作为金铃子散抗炎有效部位的判断依据，结果见图1。

图1 金铃子散抗炎有效部位的质谱分析

4 讨论与小结

金铃子散由川楝子、延胡索二药等量组成。本研究首次采用部分抗炎药理实验方法，将由石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超声提取的金铃子散不同组分通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验对金铃子散的抗炎活性部位进行了筛选。实验结果表明，金铃子散石油醚超声提取物对二甲苯所致的耳廓肿胀有抑制作用。说明抗炎活性部位主要在于极性较小的石油醚部位，该部分成分经ESI-MS直接进样分析，在m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.5、366.4具有较强的特征离子峰，在m/z400以下离子峰较多，可见此类成分的复杂性，质谱峰显示该有效部位中可能含有亚油酸、高北美圣草素、豆甾烷-3,5-二烯、去氢紫堇碱等，主要为一些挥发油成分，对于单个成分抗炎活性的研究未见报道，该有效部位的抗炎活性可能为多成分综合作用的结果，对于单个成分的抗炎活性及各成分之间是否存在协同作用有待进一步研究。但质谱离子峰的特征为金铃子散有效部位的判断提供了依据，也为最大限度的开发金铃子散的药理作用提供了实验依据。

参考文献：

[1] 谢建翔,牛丹.非甾体抗炎药不良反应报告分析[J].中国药业,2013,22(23):47-49.

[2] 李建文,朱雁.浅谈糖皮质激素的不良反应[J].北方药学,2014,11(1):87.

[3] 王绪前.金铃子散使用沿革[J].湖北中医学院学报，1993,1(1):25-26.

[4] 罗筱葵,胡伟铭,杨志彬.胃得康胶囊质量标准研究[J].井冈山大学学报:自然科学版,2013,34(4):84-89.

[5] 成龙,王岚,王彦礼,等.基于吸收-代谢模型的金铃子散复方配伍研究[J].中国中药杂志,2012,37(20):3130- 3136.

[6] 朱爱江,方步武,吴咸中,等.金铃子散的抗炎作用研究[J].中药药理与临床,2008,24(3):1-3.

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[9] 陈敏,胡芳,李丰,等.川楝子化学成分研究(Ⅲ)[J].中药材,2011,34 (12):1879-1881.

[10] 孙毅坤,雷海民,魏宁漪,等.川楝子挥发油化学成分的GC-MS分析[J].中国中药杂志，2004，29 (5)：475-476.

[11] 许翔鸿,王峥涛,余国奠，等.延胡索中生物碱成分的研究[J].中国药科大学学报,2002,33 (6):483-486.

ANTI-INFLAMMATORY ACTIVE FRACTION OF JINLINGZISAN AND ITS MS CHARACTERIZATION

*DAI Yi, JIA Xiao-yi, WANG Hai-fei

（School of Pharmaceutical Sciences of Anhui Xinhua College, Hefei, Anhui 230088,China）

Objective: To screen and characterize the anti-inflammatory effective fraction from Jinlingzisan. Methods: Jinlingzisan was ultrasonically extracted by petroleum ether, CCl4, CHCl3, ethyl acetate, methanol and water, respectively. The anti-inflammatory effective fraction was characterized by MS. Results: The petroleum ether extract of Jinlingzisan had the best anti-inflammatory effect and had ion peak of m/z 102.1, 149.2, 205.3, 279.4, 301.5 and 366.4.Conclusion: The effective fraction of anti-inflammatory from Jinlingzisan was petroleum ether extract.

Jinlingzisan; anti-inflammatory; effective fraction; MS

1674-8085(2015)01-0103-04

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.022

2014-08-17；修改日期：2014-12-12

安徽省教育厅自然科学研究项目（KJ2012Z136）

*戴 一(1979-)，男，安徽利辛人，讲师，硕士，主要从事活性天然产物研究(E-mail:daiyiii@163.com);

贾晓益(1978-)，女，浙江金华人，讲师，博士，主要从事抗炎药物研究(E-mail:jiaxiaoyi78@126.com);

王海菲(1992-)，女，安徽安庆人，安徽新华学院药学院2010级药学专业本科生(E-mail:1476374614@qq.com).