综合指标正交设计优选杭白菊挥发油萃取工艺

杨　　剑，邵　荣，王志祥，*，陈然然

（1.中国药科大学制药工程教研室，江苏南京210009；2.盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城224051）

综合指标正交设计优选杭白菊挥发油萃取工艺

杨剑1，邵荣2，王志祥1，*，陈然然1

（1.中国药科大学制药工程教研室，江苏南京210009；2.盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城224051）

以杭白菊为研究对象，超临界CO2为溶剂，β-榄香烯得率和挥发油得率为指标，分别考察颗粒粒径、萃取压力、萃取温度、萃取时间对提取过程的影响。在单因素实验的基础上，综合考虑双指标，利用正交设计，得到优化工艺条件：颗粒粒径80目，萃取压力17.24MPa，萃取温度35℃，萃取时间100min。在此条件下，杭白菊中β-榄香烯得率达到104.57mg/kg，挥发油得率达到3.26%。用综合指标优化萃取工艺条件，兼顾了杭白菊中重要抗癌活性成分β-榄香烯得率和挥发油得率，使工艺条件更加合理。

杭白菊，β-榄香烯，超临界，综合指标，正交设计

杭白菊是药食兼用的花卉，是浙江省八大名药材“浙八味”之一，具有很高的药用价值和保健价值［1］。杭白菊中主要活性成分为黄酮类物质和挥发油等。挥发油中的β-榄香烯具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤转移和主动免疫保护等作用，还有抗氧化、抗菌、抗病毒、改善微循环等作用。因其广谱、安全、有效、价廉等突出优点而具有良好的应用前景。临床上β-榄香烯可以单独使用，或与其他化疗药物合用于治疗肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌等［2］。

菊花挥发油的传统提取法为水蒸气蒸馏法，但杭白菊的有效成分中有些低沸点、易氧化物质，在水蒸气蒸馏提取时会发生变化和损失，使精油的品质下降，且挥发油得率也很低。超临界流体萃取技术具有低温提取、效率高、无溶剂残留和可选择性分离等特点，尤其适用于热不稳定的挥发性组分的提取［3］。

菊花挥发油提取工艺的文献虽有报道［4-7］，但一般均采用挥发油得率作为评价指标。本实验采用超临界萃取技术提取杭白菊中的挥发油，通过气相色谱内标法将萃取工艺过程中重要的抗癌活性成分β-榄香烯得率作为主要指标，挥发油得率作为次要指标进行测定，综合考虑双指标，优选工艺条件，进而为杭白菊中高附加值产物的开发提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

杭白菊浙江远福茶叶有限公司；β-榄香烯标准品中国药品生物制品检定所；高纯二氧化碳盐城市广源气体有限公司；正十二烷标准品上海晶纯生化科技股份有限公司；正己烷色谱纯。

SFT-100XW超临界二氧化碳萃取仪美国超临界流体技术有限公司；GC-2014气相色谱仪、AUY220电子天平日本岛津公司；720060/720050移液枪苏州百得实验室仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1提取挥发油的工艺流程取一定粒径的杭白菊，称为w0，装于茶叶袋中，称为w1，置于超临界萃取釜中萃取，收集萃出的挥发油，用正己烷定容供β-榄香烯含量测定备用，并将萃取完成后的含渣茶叶袋称为w2。则挥发油的得率计算公式为：

1.2.2色谱条件色谱柱：SE-54毛细管色谱柱（30m× 0.32mm，0.25μm）；载气：氮气；进样口温度为280℃；检测器温度：280℃；柱温：采用程序升温，起始温度为50℃，保持2min，再以5℃/min升高到260℃，保持5min。分流比：40；载气速度：30mL/min，空气：400mL/min，氢气：40mL/min；进样量：1μL［8］。

1.2.3β-榄香烯得率测定称定β-榄香烯标准品0.0403g于10mL容量瓶中，正己烷定容后精密量取1mL于25mL容量瓶中，并用正己烷定容，得到161.2μg/mL的β-榄香烯标准应用液；称定正十二烷0.5993g于10mL容量瓶中，正己烷定容后精密量取1mL于100mL容量瓶中，并用正己烷定容，得到599.3μg/mL的内标溶液；分别移取β-榄香烯标准应用液25、50、100、200、400、800μL于1mL量瓶中，并分别加入50μL内标溶液，经气相色谱制得内标标准曲线，以对照品峰面积与内标溶液峰面积之比为横坐标X，对照品浓度为纵坐标C；制得内标标准曲线为C=28.852X+0.5949（R2=0.9993，n=6），线性范围为4.03～128.96μg/mL。依据内标标准曲线可得备用液浓度。超临界萃取产物用正己烷定容于10mL量瓶中。取250μL于1mL量瓶，加入50μL内标溶液，定容得供试样品溶液。经内标标准曲线法得样品溶液中β-榄香烯含量。杭白菊中β-榄香烯含量（mg/kg）按下式计算：

式中，C为样品溶液中β榄香烯质量浓度（μg/mL）；V为供试样品溶液的体积，即1mL；M为加入萃取釜的菊花粉末质量（g）。

1.2.4单因素实验超临界二氧化碳萃取杭白菊挥发油过程中，影响萃取效果的因素较多，本实验考察菊花粉末的颗粒粒径，萃取温度，萃取压力和萃取时间这四个影响挥发油萃取效果的主要因素。确定各参数的较优条件。

1.2.4.1颗粒粒径对提取效果的影响保持CO2流量为15.00mL/min，分别取粒径为过40、60、80、100、 120目筛的菊花颗粒14.0g，萃取温度为45℃，萃取压力为17.24MPa，萃取60min，研究不同颗粒粒径对β-榄香烯得率和菊花挥发油得率的影响。

1.2.4.2萃取温度对提取效果的影响保持CO2流量为15.00mL/min，取粒径为过100目筛的菊花颗粒14.0g，萃取温度分别采用32、35、40、45、50℃，萃取压力为17.24MPa，萃取60min，研究不同萃取温度对β-榄香烯得率和菊花挥发油得率的影响。

1.2.4.3萃取压力对提取效果的影响保持CO2流量为15.00mL/min，取粒径为过100目筛的菊花颗粒14.0g，萃取温度为35℃，萃取压力分别采用10.34、13.79、17.24、20.68、24.13MPa，萃取60min，研究不同萃取压力对β-榄香烯得率和菊花挥发油得率的影响。

1.2.4.4萃取时间对提取效果的影响保持CO2流量为15.00mL/min，取粒径为过100目筛的菊花颗粒14.0g，萃取温度为35℃，萃取压力为17.24MPa，分别萃取40、60、80、100、120min，研究不同萃取时间对β-榄香烯得率和菊花挥发油得率的影响。

1.2.5工艺评价指标β-榄香烯是杭白菊挥发油中的一种重要的活性成分，在本实验中，以β-榄香烯得率和杭白菊挥发油得率作为评价指标。根据两指标的主次顺序，设定β-榄香烯权重系数为0.8，挥发油权重系数为0.2［9］。提取工艺优化过程中，分别测定两者得率，再通过给出的统计权重算出工艺评价参数，对优化工艺进行评价。评价参数的表达式如下：

1.2.6正交设计在单因素实验的基础上，采用超临界萃取工艺，选择颗粒粒径、萃取温度、萃取压力、萃取时间四个因素，以β-榄香烯的得率和杭白菊挥发油的得率为考察指标，选用正交设计表L9（34）进行实验，因素水平表见表1。

表1　L9（34）正交实验因素水平表Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal experiments

1.2.7数据处理实验过程中每个处理均重复三次，取其平均值。单因素实验与正交实验采用Origin pro 7.5和Excel 2010处理数据。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1颗粒粒径对提取效果的影响由图1可知，随着目数增加，β-榄香烯得率先上升后下降。在40～100目，随着粒径减小，β-榄香烯得率缓慢升高，这是因为随着颗粒粒径的减小，内传质阻力减小，传质速率增大。但随后到120目时，β-榄香烯得率骤降至较低水平，可能是因为菊花颗粒粒径较小时，超临界CO2流过萃取器中固体介质床层时没有与固体介质有效接触，没有发挥萃取作用，从而导致整体萃取效率下降。另外，粉碎过程中颗粒过细可能导致挥发性成分的直接流失。杭白菊挥发油得率随着目数的增加先升高后降低，40～80目提高较快，在80目时达到最高。随着粒径进一步减小，挥发油得率急剧下降。在60～100目时，粒径对β-榄香烯得率影响甚微，但对挥发油得率影响显著。故选择粒径在60～100目比较适宜。

图1　颗粒粒径对β-榄香烯和挥发油得率的影响Fig.1　Influence of particle diameter on β-elemene and volatile oil yield

2.1.2萃取温度对提取效果的影响由图2可知，随着萃取温度的升高，β-榄香烯得率先升高后下降。在32～35℃，随着温度的升高，β-榄香烯得率急剧升高，这是因为温度升高时，β-榄香烯的蒸气压增大，在超临界流体中的溶解度增大。在35～50℃，温度升高，超临界流体的密度降低，超临界流体溶解β-榄香烯的能力下降，至50℃时，β-榄香烯得率下降到较低水平。总体上讲，杭白菊挥发油得率随温度升高而缓慢升高，在35～45℃基本保持不变。综合考虑，萃取温度选择在35～45℃较为合理。

图2　萃取温度对β-榄香烯和挥发油得率的影响Fig.2　Influence of extraction temperature on β-elemeneextraction yield and volatile oil yield

2.1.3萃取压力对提取效果的影响由图3可知，β-榄香烯得率随着压力增大先升高后降低，在10.34～17.24MPa，压力越高，超临界CO2的密度越大，超临界CO2的溶解能力越高。17.24MPa以后，随着压力进一步升高，β-榄香烯的扩散系数也会逐渐减小，同时萃取过程中分离选择性降低，最终导致β-榄香烯得率降低。杭白菊挥发油得率随着压力增加先升高后降低，同样在17.24MPa达到最高。高压条件下选择性差，挥发油品质较低，同时考虑到工业规模设备选型和操作要求，选择较低压力为宜。所以萃取压力选择在10.34～17.24MPa比较合适。

图3　萃取压力对β-榄香烯和挥发油得率的影响Fig.3　Influence of extraction pressure on β-elemene extraction yield and volatile oil yield

2.1.4萃取时间对提取效果的影响由图4可知，随着萃取时间的增加，β-榄香烯得率先升高后降低。在40～100min，随着萃取时间的增加，β-榄香烯得率逐渐提高，这是因为随着萃取时间的延长，溶质会被萃取的越来越充分。然而100min之后，β-榄香烯得率可能由于逸散损失逐渐下降。同时，萃取时间过长会将其他物质萃取出来，导致选择性变差，挥发油品质下降。杭白菊挥发油得率随着萃取时间的延长也是先升高后降低，在100min时达到最大值。同时考虑设备的运行成本和挥发油的品质，萃取时间选择在60～100min比较合理。

图4　萃取时间对β-榄香烯和挥发油得率的影响Fig.4　Influence of extraction time on β-elemene extraction yield and volatile oil yield

2.2正交设计优化杭白菊挥发油萃取工艺

在单因素实验的基础上，对影响得率的四个因素按照表1进行正交实验，正交实验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

极差分析结果为RC＞RD＞RB＞RA，即对杭白菊挥发油提取效果影响的主次顺序为：萃取压力＞萃取时间＞萃取温度＞颗粒粒径。表3方差分析结果为FC＞FD＞F0.05＞FB＞FA，表明萃取压力和萃取时间对杭白菊挥发油萃取效果影响显著，而萃取温度和颗粒粒影响不显著。最佳提取工艺条件为A2B1C3D3，即颗粒粒径选用80目，萃取温度为35℃，萃取压力为17.24MPa，萃取时间为100min。在此工艺条件下进行了三次平行实验，综合评价参数为105.79，β-榄香烯的平均得率为104.57mg/kg，杭白菊挥发油的平均得率为3.26%。而利用水蒸气蒸馏法从杭白菊中获得的β-榄香烯得率为12.98mg/kg［10］，挥发油得率为0.55%［6］，均远远低于超临界CO2萃取法。

表2　正交实验设计与结果Table 2　Design and results of orthogonal experiment

表3　正交实验方差分析结果Table 3　Variance analysis results of orthogonal experiment

3　结论

通过单因素实验和正交设计对杭白菊中挥发油提取工艺进行优化。最终确定的优选工艺条件为颗粒粒径80目，萃取温度35℃，萃取压力17.24MPa，萃取时间100min，在此实验条件下，β-榄香烯的平均得率为104.57mg/kg，杭白菊挥发油的平均得率为3.26%。采用超临界CO2萃取技术对杭白菊中挥发油成分进行了萃取，与传统的水蒸气蒸馏法相比，显著降低了提取温度，缩短了提取时间，大大减少了β-榄香烯在提取过程的氧化变质的发生。

［1］周丽，张维，王斌.杭白菊的有效成分及深加工研究进展［J］.食品工业，2014，35（6）：199-202.

［2］陈美婉，钟章锋，王胜鹏，等.β-榄香烯抗癌活性及其新型给药系统的研究进展［J］.中国新药杂志，2012，21（12）：1358-1361.

［3］金建忠.超临界二氧化碳萃取杭白菊挥发油工艺研究［C］.第八届全国药用植物及植物药学术研讨会，2009.

［4］杨立刚，李莉华，林丽凤，等.南京菊花脑部分成分分析及挥发油的提取研究［J］.现代食品科技，2010，26（2）：212-214.

［5］钟才宁，何敏，杨再波，等.均匀设计优化野菊花挥发油提取工艺及抗氧化研究［J］.时珍国医国药，2009，20（4）：888-889.

［6］张菲菲，马永建，孙桂菊，等.菊花挥发油提取工艺研究［J］.时珍国医国药，2008，19（4）：834-836.

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［9］李旭，刘停.杜仲叶总黄酮微波辅助提取工艺的优化及其抗氧化性研究［J］.食品工业科技，2013，34（4）：243-248.

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Optimization of extraction conditions of volatile oil from Chrysanthemum morifolium Ramat by orthogonal design

YANG Jian1，SHAO Rong2，WANG Zhi-xiang1，*，CHEN Ran-ran1
（1.China Pharmaceutical University，Pharmaceutical Engineering Teaching and Research Section，Nanjing 210009，China；2.Yancheng Institute of Technology，School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng 224051，China）

With Chrysanthemum morifolium Ramat as the research object，supercritical CO2as solvent，the βelemene yield and volatile oil yield as measure indicators，the effects of four extraction parameters including particle diameter，extraction pressure，extraction temperature，extraction time on extraction processes were separately studied.Then it was optimized using orthogonal design based on single factor investigations for achieving higher β-elemene extraction yield and volatile oil extraction yield.Under the condition of particle diameter of 80 meshes，extraction pressure of 17.24MPa，extraction temperature of 35℃，extraction time of 100min，the β-elemene yield was 104.57mg/kg and the volatile oil yield was 3.26%.It gave priority to βelemene yield with due consideration to volatile oil yield with comprehensive index orthogonal design.It made process conditions more reasonable.

Chrysanthemum morifolium Ramat；β-elemene；supercritical；comprehensive index；orthogonal design

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0270-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.048

2014－09－23

杨剑（1989-），男，硕士，研究方向：制药分离工程。

王志祥（1968-），男，教授，研究方向：制药分离工程。