榄香烯和PD98059诱导人胃癌SCG-7901细胞株凋亡及其机制的探讨

俞耀军，盛维为，叶海波，屠洋洋，刘帅，孙维建，游涛，王飞海，郑志强

（温州医科大学附属第二医院 胃肠外科，浙江 温州 325027）

榄香烯和PD98059诱导人胃癌SCG-7901细胞株凋亡及其机制的探讨

俞耀军，盛维为，叶海波，屠洋洋，刘帅，孙维建，游涛，王飞海，郑志强

（温州医科大学附属第二医院 胃肠外科，浙江 温州 325027）

目的：探讨榄香烯及PD98059对人胃癌SCG-7901细胞株凋亡的影响，及其与ERK1/2、P38MAPK信号通路的关系。方法：用不同浓度的榄香烯和PD98059处理人胃癌SCG-7901细胞，体外细胞增殖抑制实验（MTT）法检测细胞增殖情况；Western-blot法检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化P38（p-P38）的表达；RT-PCR检测bcl-2 mRNA及bax mRNA的表达；TUNEL法检测胃癌细胞凋亡并计算凋亡指数。结果：榄香烯和PD98059单独作用都有抑制胃癌细胞增殖的作用，前者呈浓度和时间依赖性，后者则呈时间依赖性但无浓度依赖性，两药联合作用时对胃癌细胞增殖的抑制作用显著大于单一用药时（P＜0.05）；随榄香烯的浓度增加p-ERK1/2蛋白的表达量增加（P＜0.05），总ERK1/2无明显变化；榄香烯（0.08 mg/ mL）、PD98059（50 μmol/L）及榄香烯+PD98059组作用胃癌细胞24 h，p-P38的表达均高于对照组（P＜0.05），且榄香烯+PD98059组较榄香烯组或PD98059组更高（P＜0.05）；随榄香烯浓度的增加，bax mRNA的表达增加，bcl-2 mRNA的表达降低，且榄香烯+PD98059组表现最显著；实验组细胞凋亡率均高于对照组（P＜0.05），具有浓度依赖性（P＜0.05），且榄香烯+PD98059组的凋亡率明显高于单一作用组（P＜0.05）。结论：榄香烯及PD98059可以抑制胃癌细胞增殖，前者具有时间和浓度依赖性；榄香烯及PD98059还可以促进胃癌细胞凋亡。榄香烯抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的机制包括促进ERK1/2磷酸化和上调p-P38MAPK信号通路的表达；PD98059抑制ERK1/2的磷酸化，但通过上调p-P38 MAPK信号通路的表达而发挥其细胞调节作用。

胃肿瘤；榄香烯；PD98059；细胞凋亡；ERK1/2；P38MAPK

榄香烯是从香茅草中提取的有效抗癌成分，具有抗肿瘤谱广、不良反应轻微的突出优点。研究[1-4]证明榄香烯对多种肿瘤，如胰腺癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病等具有增殖抑制和凋亡诱导作用。有文献[5-6]报道，榄香烯抗胃癌作用与下调生存素表达，增强天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶活性及下调过氧化物酶体增殖激活物受体γ mRNA表达有关。我们的前期研究[7]发现榄香烯可以通过上调p-P38MAPK信号通路而抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。P38MAPK、ERK1/2通路均为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路的分支，然而榄香烯是否也通过ERK1/2通路产生作用，ERK1/2与P38MAPK通路之间是否存在相互作用，目前鲜见相关报道。PD98059为ERK1/2的特异性抑制剂，可以抑制ERK1/2的磷酸化。本研究进一步探讨榄香烯、PD98059对人胃癌细胞SGC-7901凋亡的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 试剂和药品RPMIl640培养基（美国Gibcol公司）；胰蛋白酶-EDTA（美国Gibicol公司）；体外细胞增殖抑制实验（MTT）试剂盒（美国Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；榄香烯注射液（国药准字H109601 15，大连金港制药有限公司）；兔抗人p-P38、兔抗人ERK1/2及p-ERK1/2一抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；PD98059（美国Sigma公司）；TUNEL试剂盒（美国Roche公司）；细胞裂解液Trizol（Invitrogen公司）；反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；SYBR Green（美国Roche公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养：采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的RPMIl640培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%、相对湿度95%条件下培养胃癌SGC-7901细胞株。用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化传代细胞。选用对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 MTT法：取对数生长期细胞，以4 000个/孔接种于96孔板，每孔体积100μL，置37 ℃、5% C02及95%相对湿度培养箱中培养24 h，按照实验要求分为空白组、对照组和实验组，实验组包括榄香烯组、PD98059组、榄香烯+PD98059组，每组设5个复孔。空白组不种细胞；对照组不做干预；榄香烯组榄香烯终浓度分别为0.02、0.04、0.08和0.16 mg/mL；PD98059组PD98059终浓度分别为25、50、75和100μmol/L；榄香烯+PD98059组为0.08 mg/mL的榄香烯+50μmol/L PD98059。分别培养6、12、24和48 h，每孔加入5 mg/mL MTT试剂20 μL，继续孵育4 h后，吸去孔内培养液，每孔加150μ L DMSO振荡混匀，选择492 nm波长，在自动酶标仪上测定各孔吸光度（A值），计算抑制率。细胞增殖抑制率=[1-（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%]。

1.3.3 Western-blot法：对照组、榄香烯组（0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL）、PD98059组（50μ mol/ L）、榄香烯+PD98059组（0.08 mg/mL榄香烯+50 μmol/L PD98059）作用24 h，提取总蛋白，并计算出上样体积。变性后SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜，然后分别加入ERK1/2（1:1 000）、p-ERK1/2（1:1 000）、p-P38一抗（1:500）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入HRP标记的IgG二抗（1:6 000）室温孵育2 h，应用超敏ECL化学发光试剂盒曝光，以tubu-lin蛋白作为内参照。采用ImageTool凝胶图像分析系统进行分析。观察ERK1/2、p-ERK1/2、p-P38蛋白的表达情况。

1.3.4 Real-time PCR：将对照组、榄香烯组（0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL）、PD98059组（50μ mol/ L）、榄香烯+PD98059组（0.08 mg/mL榄香烯+50 μ mol/L PD98059）细胞按照1×104/孔密度接种于6孔板，待细胞贴壁后分别加药物作用24 h，采用Trizol法提取各孔中总的RNA，产物加入20 mL DEPC水溶解，测OD值，OD260/OD280均在1.8～2.0之间。按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录获得cDNA，RT-PCR检测采用10μL体系，成分为：SYBR Green 5μ L，上下引物分别为0.5μ L，稀释后的模板DNA 2μ L，无菌ddH2O 2μ L。反应条件为：95 ℃15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环；最后95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ l min。同时扩增β-actin作为内参对照，观察bcl-2 mRNA、bax mRNA的表达情况。bcl-2上游引物为5’-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3’，下游引物为5’-GTTGACGCT CTCCACACACAT-3’；bax上游引物为5’-TTTCTGACGGCA ACTTCAACTG-3’，下游引物为5’-CAACCACCCTGGTCTTG GAT-3’；内参基因β-actin上游引物为5’-CGTGGACA TCCGCAAAGAC-3’，下游引物为5’-AAGAAAGGGTGTAACG CAACTAAG-3’。结果判定：实验组相对于对照组的表达量=2-ΔΔCt。

1.3.5 TUNEL法检测细胞凋亡：对照组、榄香烯组（0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL）、PD98059组（50 μ mol/L）、榄香烯+PD98059组（0.08 mg/mL榄香烯+50 μmol/L PD98059）以l×104个/mL的密度将细胞接种于预先放置盖玻片的6孔板中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，过夜后各孔加药物干预作用24 h。按TUNEL检测试剂盒说明书进行操作并加以改进，取出带有细胞的载玻片，用4%多聚甲醛室温固定1 h，PBS洗2 min×3次，0.3% H202室温作用30 min，PBS洗5 min×3次，体积分数0.1% Triton×100，4 ℃作用2 min。PBS洗5 min×3次，滴加TUNEL反应液50 μL。在湿盒内37 ℃温育l h，PBS洗后加过氧化物酶转化剂，37 ℃温育30 min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。TUNEL反应液中不加TdT酶作为阴性对照，用DNase I部分降解的标本作为阳性对照组，细胞核呈棕褐色或棕黑色的为凋亡细胞。在高倍镜下随机取5个视野，总细胞数＞1 000个，计算凋亡指数，凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.4 统计学处理方法采用SPSSl3.0统计软件进行分析。每组实验重复3次。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD检验；组间率的比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 榄香烯、PD98059对胃癌细胞SGC-790l细胞的增殖抑制作用MTT法检测显示榄香烯、PD98059能够显著抑制细胞增殖，前者随着药物浓度的增加和作用时间的延长抑制率逐渐增加，呈现浓度和时间依赖性，后者呈时间依赖性，而二者联用较单一作用效果更明显（见图1、表1）。

图1 不同浓度榄香烯及PD98059对胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制曲线

2.2 Westren-blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2、p-P38的表达情况

2.2.1 不同浓度榄香烯作用胃癌SCG-7901细胞24 h后各组ERK1/2、p-ERK1/2表达情况：随着榄香烯浓度的增加，REK1/2的表达无明显变化，p-ERK1/2的表达逐渐增加，浓度为0.08 mg/mL后，p-ERK1/2被迅速激活，p-ERK1/2相对表达量为对照组的2.68倍。详见图2、表2。

表1 不同浓度榄香烯及PD98059对胃癌SGC-7901细胞株增殖的影响（n=5）

图2 不同浓度榄香烯作用24 h后ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达情况

表2 不同浓度榄香烯作用胃癌SCG-7901细胞后各组ERK1/ 2、p-ERK1/2蛋白相对表达量

2.2.2 榄香烯、PD98059及榄香烯+PD98059作用SCG-7901细胞后各组ERK1/2、p-ERK1/2表达情况：作用24 h后与对照组比较，榄香烯（0.08 mg/mL）组SCG-7901细胞p-ERK1/2表达明显增加（P＜0.05），PD98059（50μ mol/L）组p-ERK1/2表达明显降低（P＜0.05），榄香烯+PD98059组则差异无统计学意义；但榄香烯+PD98059组较榄香烯组p-ERK1/2表达降低，较PD98059组则表达增加（P＜0.05）。各组间ERK1/2表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05），详见图3、表3。

图3 各组ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达情况

表3 榄香烯、PD98059及榄香烯+PD98059作用SCG-7901细胞后各组ERK1/2、p-ERK1/2、p-P38相对表达量

2.2.3 榄香烯、PD98059及榄香烯+PD98059作用SCG-7901细胞后各组p-P38表达情况：作用24 h后与对照组比较，榄香烯（0.08 mg/mL）组、PD98059（50μ mol/L）组及榄香烯+PD98059组p-P38表达均明显增加（P＜0.05），且榄香烯+PD98059组较单一用药组p-P38表达量增加（P＜0.05），详见图4、表3。

图4 各组p-P38蛋白表达情况

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡实验结果显示阴性对照组细胞呈多边形或多角形，染色质呈颗粒状，染成淡蓝色，极少数细胞被染成棕褐色，经榄香烯、PD98059、榄香烯+PD98059处理后的SGC7901细胞明显变小，染色质呈团块状，边聚核固缩被染成棕褐色，呈凋亡的形态改变，详见图5。与对照组相比，榄香烯（0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL）组及PD98059（50μmol/L）组、榄香烯+PD98059组凋亡率明显增高，且随榄香烯浓度增高，凋亡率明显增高。对照组细胞凋亡指数为3.25%±0.24%，0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的榄香烯组凋亡指数分别为8.26%±0.54%、17.34%±0.68%、25.87% ±1.04%、35.67%±0.84%，PD98059组为15.05% ±0.25%，PD98059+榄香烯组为41.34%±0.89%，实验组较对照组明显增高，差异均有统计学意义（P＜0.05），其余各组间相比差异亦均有统计学意义（P＜0.05）。

图5 TUNEL法检测各组细胞凋亡情况（×400）

2.4 RT-PCR结果随着榄香烯浓度的升高，bax mRNA的表达增加，而bcl-2 mRNA的表达降低；PD98059组及榄香烯+PD98059组相比于对照组，bax mRNA的表达增加，bcl-2 mRNA的表达降低。榄香烯浓度为0.02 mg/mL时bax mRNA的表达量为对照组的1.3985倍，到0.16 mg/mL时为3.4382倍，榄香烯+PD98059组升高最明显，为对照组的4.8636倍（见表4）。榄香烯浓度为0.02 mg/mL时bcl-2 mRNA表达水平为对照组的0.9634倍，到0.16 mg/mL时为0.3020倍，榄香烯+PD98059组下降最明显，为0.1763倍（见表4）。

表4 不同浓度榄香烯及PD98059对胃癌SGC-7901细胞bax mRNA、bcl-2 mRNA表达的影响（n=3）

3 讨论

全球胃癌发病率高，由胃癌导致的死亡人数仅次于肺癌，在恶性肿瘤中位居第二，而在我国各种恶性肿瘤中居首位[8]。目前治疗以手术联合细胞毒性化疗药物为主，而化疗对重要器官的损伤和肿瘤耐药是临床经常遇到的难题。大量研究表明榄香烯能够抑制包括胃癌在内的多种肿瘤细胞的增殖[1-7，9-11］。榄香烯发挥抗肿瘤效应是一个极其复杂的生物学过程，其具体作用机制尚不清楚。

Liu等[12]研究了β-榄香烯对人胃癌细胞的抗肿瘤效应及其机制，认为β-榄香烯通过抑制PI3K/Akt/ mTOR通路，一方面抑制细胞增殖、促进凋亡，另一方面激活一个保护性的自噬体从而避免细胞凋亡。Qu等[13]研究发现，在胃癌细胞中，激活ERK信号通路可以上调DR4、DR5的表达，从而通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）诱导细胞凋亡。

本研究采用不同浓度的榄香烯作用胃癌细胞株SGC-7901，发现随着药物浓度的增加和作用时间的延长，胃癌细胞的增殖抑制率逐渐增加，而采用不同浓度的PD98059作用于胃癌细胞，胃癌细胞的增殖抑制率并不随其浓度的增加而增加，而是随时间的延长而增加；当榄香烯和PD98059同时作用于胃癌细胞时，其对细胞株的增殖抑制率明显比同一浓度的榄香烯或PD98059单一作用时高。我们通过Westren-blot法检测ERK1/2蛋白的表达，发现随着榄香烯浓度的增加，p-ERK1/2的表达逐渐增加，总ERK1/2则没有明显变化，说明榄香烯可以通过促进ERK1/2的磷酸化而发挥作用，同样，在加入ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059后，更能证明这一结论。我们还发现榄香烯及PD98059都能明显促进p-P38MAPK的表达，并且二者合用比单一用药时效果更显著，这一结果同文献[14-15]的报道一致。

bcl-2、bax为癌基因家族的成员之一，前者是凋亡抑制基因，后者则是促凋亡基因。二者的比值决定细胞接受刺激信号后是凋亡还是存活[16]。本研究通过TUNEL法观察到榄香烯促进胃癌细胞凋亡，其凋亡率随榄香烯浓度的增高而增高。PD98059亦可促进胃癌细胞凋亡，且二者联合作用较单一作用明显。通过RT-PCR检测发现bax mRNA的表达随榄香烯浓度的增高而增加，但是bcl-2 mRNA的表达则降低，这提示榄香烯及PD98059可能通过RAS/RAF/ERK、P38MAPK通路诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡[17-19]。本研究结果表明，榄香烯抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖、诱导其凋亡与p-ERK1/2以及p-P38表达增加、bcl-2表达下降和bax表达增加有关；PD98059抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖、诱导其凋亡与p-P38表达增加、bcl-2表达下降和bax表达增加有关，联合榄香烯和PD98059作用后效果更加明显。

综上所述，本实验研究表明，榄香烯及PD98059可以抑制胃癌细胞增殖，前者具有时间和浓度依赖性；榄香烯及PD98059还可以促进胃癌细胞凋亡。榄

香烯抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的机制包括促进ERK1/2磷酸化和上调p-P38MAPK信号通路的表达；PD98059抑制ERK1/2的磷酸化，但通过上调p-P38 MAPK信号通路的表达而发挥其细胞调节作用。

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（本文编辑：丁敏娇）

The mechanism of elemene and PD98059 inducing apoptosis of human gastric cancer cell line SCG-7901

YU Yaojun, SHENG Weiwei, YE Haibo, TU Yangyang, LIU Shuai, SUN Weijian, YOU Tao, WANG Feihai, ZHENG Zhiqiang.Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To explore the effect of elemene and PD98059 on the apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-790l and the relationship of ERK1/2, P38MAPK signal pathway.Methods:SGC-790l cells were treated with elemene and PD98059. MTT assay was used to detect the proliferation of SGC-790l cells. The expression of ERK1/2, phosphorylation REK1/2 (p-ERK1/2) and phosphorylated P38 (p-P38) was detected by western-blot.The bcl-2 mRNA and bax mRNA was detected with RT-PCR. The gastric cancer cell apoptosis index was detected by TUNEL method.Results:Elemene and PD98059 alone effectively inhibited the proliferation of gastric cancer cells SGC-7901, and the former was in a dose-dependent and time-dependent manner, the latter was in a time-dependence but no in dose-dependent manner, and the combined effects of the two drugs on gastric cancer cell proliferation inhibition was significantly greater than that of single agent (P<0.05). The expression of p-ERK1/2 protein was increased (P<0.05), and the total ERK1/2 was no significant change with the concentration of elemene increased. The expression of p-P38 of elemene group, PD98059 group and the combined group were significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the combined group was the highest (P<0.05). The mRNA of bcl-2 expression was down-regulated while the expression of bax mRNA was up-regulated and both changes had good dose-dependent tendency, and the combined group was most significantly. Cell in experimental groupsapoptosis rate was higher than that in the control group (P<0.05), and in a dose-dependent manner with elemene (P<0.05).The apoptosis rate of elemene+PD98059 group was significantly higher than that of the single-action group (P<0.05). Conclusion: Elemene and PD98059 can inhibite the proliferation of gastric cancer cells SGC-7901, and the former was in a dose-dependent and time-dependent manner. Elemene and PD98059 can also promote the apoptosis of gastric cancer cells. Elemene promotes apoptosis and inhibites the proliferation of gastric cancer cells by up-regulating the expression of p-ERK1/2 signaling pathway and p-P38MAPK signaling pathway. PD98059 inhibites the ERK1/2 phosphorylation, but can promote the expression of p-P38 MAPK signaling pathway, then inhibites the proliferation and promotes gastric cancer cell apoptosis.

gastric cancer; elemene; PD98059; apoptosis; ERK1/2; P38MAPK

R735.2

A

1000-2138（2014）04-0258-07

2013-11-05

浙江省卫生厅科研基金资助项目（2011KYA112）。

俞耀军（1977-），男，浙江绍兴人，主治医师，硕士。

郑志强，教授，硕士生导师，Email：zzq652992@163.com。