响应面法优化臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌工艺

龚　媛，刘敦华，曲云卿，廖若宇，徐梦霞

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

响应面法优化臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌工艺

龚媛1，刘敦华2，*，曲云卿3，廖若宇3，徐梦霞3

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

以枸杞干果为原料，采用臭氧与紫外复合处理进行杀菌，通过响应面分析优化确定出臭氧与紫外复合处理枸杞杀菌的最佳工艺条件为：辐射距离31cm、处理时间32min、臭氧浓度31mg/m3，在此工艺条件下测得臭氧紫外复合处理杀菌率为99.999%，在最佳工艺条件下处理对枸杞干果品质无显著影响（p＞0.05），表明臭氧与紫外复合作用在杀菌方面具有一定的优势。本文为宁夏枸杞微生物降解提供了科学的数据和有效的技术手段。

枸杞，臭氧与紫外复合处理，杀菌率

随着生活水平的提高，人们越来越注重保健，医学证明枸杞具有保护肝脏、抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤等作用［1-2］，但因市售枸杞干果的微生物超标等问题，枸杞的质量问题备受关注。因此探寻一种方法以解决超标问题是非常有必要的。

降解果蔬表面微生物主要方法有：臭氧降解、紫外降解、微波降解、微生物降解等。臭氧是一种不稳定伴有特殊气味的气体，具有强氧化性，中间不产生有害产物，单个的氧原子具有极强的氧化性，其强的氧化作用能杀灭多种致病微生物，而多余的氧原子在30min后又会转化成稳态的氧分子，不会产生有毒有害的残留物［3-5］。紫外降解微生物、农药残留主要利用短波紫外线（254nm）的作用，是能量作用最强的紫外线，一般用来杀死细菌和病毒［6］，但会产生细菌增殖等问题［7］。单独使用臭氧处理含有水的食品，可能会产生致突变物，会影响人类健康，并且对枸杞干果的杀菌效果也不明显。而臭氧-紫外光辐射联用法（O3/UV）法的氧化过程首先是液相臭氧在紫外光辐射下分解产生OH自由基，再由OH自由基氧化水中的污染物［8］，大大提高了难氧化物质的氧化速率。

本研究以枸杞干果为原料，采用臭氧紫外复合处理进行杀菌，通过响应面分析优化确定出臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌效果的最佳工艺条件，以期为宁夏枸杞微生物降解提供了科学的数据和有效的技术手段。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

枸杞干果宁夏银川同心路市场，宁杞1号，水分：11.5874%。

AL204型电子天平梅勒-勒托利多仪器（上海）有限公司；AB-K-Y-10型移动式臭氧发生器南京奥坂干燥设备厂；DZF-6020型真空干燥箱、DNP-9052型电热恒温培养箱、JH-SCA型超净工作台上海鸿都电子科技有限公司；GJWS-A2型温湿度表天津市津南区工艺美术陶瓷厂；7230G可见分光光度计上海精密科技有限公司；EST-10-03型臭氧浓度检测仪深圳市源恒通科技有限公司；20W双端双针石英紫外线杀菌消毒灯东海县创新灯具厂；PW103型空气加湿器上海奔腾企业有限公司。

1.2实验方法

1.2.1枸杞杀菌流程在密封的4m2无菌室里用（智能档）加湿器加湿使室内湿度达到实验所需湿度，将准确称取500g枸杞干果置于已杀过菌筛子中，关门，通入臭氧。当里面的臭氧浓度稳定时，关闭臭氧发生器，打开紫外灯，进行杀菌，杀菌结束后迅速将枸杞干果烘干装入无菌自封袋中，并封口，置于超净工作台中进行微生物检测。

1.2.2单因素实验设计分别考察辐射距离、辐射时间、臭氧浓度、臭氧处理时间以及相对湿度各因素对臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌率的影响，并对数据进行方差分析，确定各因素的适宜条件。

分别选取辐射距离30cm，辐射时间40min，臭氧浓度12.72mg/m3，臭氧处理时间30min，相对湿度90%的条件下，考察不同紫外辐射距离（10、20、30、40、50、60cm）、紫外辐射时间（20、30、40、50、60、90min）、臭氧浓度（0、6.36、12.72、25.44、38.16mg/m3）、臭氧处理时间（20、30、40、50、60min）、相对湿度（50%、60%、70%、80%、90%、95%）对臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌效果的影响。

1.2.3响应面实验设计根据单因素实验结果，采用Box-Behnken Design（BBD）实验设计拟合出多项回归模型并进行方差分析，确定出臭氧与紫外复合处理枸杞干果最大杀菌率的最优工艺条件。

在单因素实验结果的基础上选取单因素的最佳条件：辐射距离30cm、处理时间40min、臭氧浓度25.44mg/m3作为自变量，杀菌率（Y）作为响应值，根据Box-Behnken Design（BBD）实验设计原理，设计三因素三水平的响应面实验（见表1）。

表1　BBD设计因素水平表Table 1　Factors and levels in the BBD design

1.2.4枸杞干果微生物降解前后品质变化测定根据SNT 0878-2000《进出口枸杞子检验规程》测定臭氧与紫外复合处理后的枸杞干果的理化指标、微生物指标。

1.2.5微生物测定根据GB47892-2010《食品微生物学检验菌落总数测定》测定细菌总数；SNT 0169-2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》测定大肠菌群数。

1.2.6杀菌率计算公式

杀菌率（%）＝（杀菌前菌落总数-杀菌后菌落总数）/杀菌前菌落总数×100

1.2.7理化指标的测定水分：GB 5009.3《食品中水分的测定》直接干燥法；灰分：GB 5009.4《食品中灰分的测定》；总糖：GB 18672-2014《枸杞》；蛋白质：GB 5009.5《食品中蛋白质的测定》；脂肪：GB 5009.6《食品中脂肪的测定》。

1.2.8大肠菌群检测根据响应面实验优化出最佳工艺条件处理枸杞干果后，对其大肠菌群数进行检测。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1辐射距离对枸杞干果杀菌率的影响由图1可知，随着辐射距离的减小，臭氧紫外复合处理对枸杞干果的杀菌率逐渐增大，并且辐射距离越近，紫外线更易被生物体吸收，并直接作用于微生物的遗传物质DNA，使DNA结构遭到破坏，而使微生物不能繁殖生长，从而使杀菌率增大；方差分析表明，不同辐射距离之间，杀菌率呈现明显的差异性（p＜0.05），辐射距离在10、20、30cm之间差异不太明显，但辐射距离太近会影响枸杞干果的品质［9］，所以辐射距离选取的最佳范围是20～30cm。

图1　辐射距离对枸杞干果杀菌率的影响Fig.1　Influence of radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

2.1.2辐射时间对枸杞干果杀菌率的影响由图2可知，随着紫外线辐射时间的延长，臭氧紫外复合处理对枸杞干果的杀菌率逐渐增大，紫外辐射时间越长，紫外线对微生物DNA结构破坏的更彻底，微生物不能合成蛋白质和酶而死亡，从而提高了杀菌率。方差分析结果表明，当辐射时间大于40min时杀菌率达97%以上，60～90min时，杀菌率无明显差异（p＞0.05），并且在90min时，杀菌率达到99.99%，考虑到紫外长时间作用枸杞干果对其品质的影响，所以辐射时间的最佳范围50～60min。

2.1.3臭氧浓度对枸杞干果表面微生物杀菌率的影响由图3及方差分析可知，随着臭氧浓度的增大，臭氧紫外复合处理枸杞干果的杀菌率逐渐增大，在低浓度范围内，不同臭氧浓度对枸杞干果杀菌率的影响存在着显著差异，高浓度的臭氧对枸杞干果杀菌率的影响无明显差异（p＜0.05），臭氧杀菌是通果破坏细胞膜成分，改变细胞膜通透性，阻止菌体新陈代谢从而达到杀菌的作用，臭氧浓度越高，阻止菌体新陈代谢的效果越好，杀菌效果也就越明显，但高浓度的臭氧会对人体和大气造成很大的危害，所以臭氧浓度的最佳范围为12.72～38.17mg/m3。

2.1.4臭氧处理时间对枸杞干果杀菌率的影响由图4可知，随着臭氧处理时间的延长，臭氧紫外复合处理对枸杞干果的杀菌率逐渐增高，方差分析表明，在50min之前不同臭氧处理时间的杀菌率存在着显著差异（p＜0.05），这是因为一定浓度的臭氧破坏微生物细胞膜的成分，阻止菌体新陈代谢，臭氧会随处理时间的延长继续渗透于菌体内部使其死亡，本实验臭氧处理时间在50min以上，杀菌率无显著性差异，综合考虑，臭氧处理时间范围是30～60min。

2.1.5相对湿度对枸杞干果杀菌率的影响由图5可知，随着室内相对湿度的增加，臭氧紫外复合处理枸杞干果的杀菌率总体呈上升的趋势，说明增加相对湿度可以提高臭氧紫外复合处理的杀菌率，这与国内外相关报道一致［10-11］。主要是因为湿度越大，微生物细胞膜因膨胀而变薄，其组织更易被臭氧破坏。方差分析可知，相对湿度对杀菌率的影响极显著（p＜0.01），当相对湿度大于90%时，杀菌率无明显差异，根据文献［12］，相对湿度越高杀菌效果越明显，此实验相对湿度最佳取值应为90%±5%。

图2　辐射时间对枸杞干果杀菌率的影响Fig.2　Influence of radiation time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

图3　臭氧浓度对枸杞干果杀菌率的影响Fig.3　Influence of the ozone concentration on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

图4　臭氧处理时间对枸杞干果杀菌率的影响Fig.4　Influence of the ozone processing time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

图5　相对湿度对枸杞干果杀菌率的影响Fig.5　Influence of relative humidity on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由单因素实验结果分析可得，此实验是臭氧紫外复合处理枸杞干果，辐射时间与臭氧处理时间最佳范围大致相同，所以将这两个因素合并为一个因素：处理时间，综合考虑，确定出单因素实验的最佳条件为：相对湿度90%±5%，辐射距离30cm，处理时间40min，臭氧浓度25.44mg/m3。

2.2响应面实验结果及分析

2.2.1实验设计与结果该研究选用Box-Behnken Design（BBD）实验设计，整个实验设计在三个中心点处共进行15次实验，其中12次是分析实验，实验结果随机完成，结果见表2。

通过Design Expert软件对实验数据进行回归分析，得到响应值与各因素之间二次多元回归拟合方程如下：

Y=99.88-0.35X1+0.062X2+2.27X3+0.095X1X2+ 0.28X1X3-0.69X12-0.68X22-1.53X32，对此模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，该模型极显著（p＜0.0001），表明本实验采用的二次模型具有统计学意义；臭氧紫外杀菌率失拟项p=0.0711不显著，表明该模型与实际实验拟合程度较好，实验误差小，可以用来预测臭氧紫外复合作用对枸杞干果微生物杀菌工艺的条件。方程的一次项中X1、X3，二次项X12、X22、X32，交互项X1X3对响应值的影响极显著（p＜0.01）。表明实验的各因素与响应值之间关系复杂，不是简单的线性关系。由F值的大小，可以反映出各实验因素对响应值影响程度，F值越大，表明对响应值的影响越大。通过方差分析表可知，对枸杞干果微生物杀菌率影响程度的大小顺序是：臭氧浓度＞辐射距离＞处理时间。

2.2.2响应面分析经Design Expert v8.0.6 Trial软件分析，由回归方程分析得到杀菌率与各因素的响应面结果见图。3D响应面图将二次回归模型直观的展现出来。在响应面图中，曲面越陡峭，表明该实验因素对响应值的影响越显著。等高线图与响应面图相对应，等高线图随着响应面图的变化而变化，其曲线越接近中心，则对应的响应值也就越大［13］。

表2　BBD实验设计与结果Table 2　Design and result of BBD

表3　臭氧紫外复合杀菌率研究模型的方差分析结果Table 3　Research model analysis of variance for ozone and ultraviolet combined sterilization efficiency

图6表示了处理时间和辐射距离对枸杞干果杀菌率的交互作用，随着辐射距离的增大，杀菌率逐渐降低，当辐射距离大于30cm时，随着处理时间的延长，杀菌率逐渐升高，说明距离远时，处理时间影响比较显著，而从整个交互作用来看，辐射距离对杀菌率影响比较大。

图6　处理时间和辐射距离对枸杞干果杀菌率影响的响应面Fig.6　Response surface showing the effects of processing time and radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由图7可以看出，无论处理时间短还是长，随着臭氧浓度的增大，杀菌率都明显增大。臭氧浓度一定时，随着处理时间的增加，杀菌率呈缓慢的先增后减。

图7　臭氧浓度和处理时间对枸杞干果杀菌率影响的响应面Fig.7　Response surface showing the effects of the ozone concentration and processing time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由图8可以看出，响应面陡峭，臭氧浓度和辐射距离的交互作用对枸杞干果杀菌率的影响很显著，当辐射距离小于40cm时，随着臭氧浓度的增大，杀菌率都明显增大，并能接近100%，但当辐射距离为40cm时，虽然杀菌率随臭氧浓度的增大而增大，当杀菌率永远都达不到100%；臭氧浓度一定时，随着辐射距离的增大，杀菌率呈缓慢的先增后减。

图8　臭氧浓度和辐射距离对枸杞干果杀菌率影响的响应面Fig.8　Response surface showing the effects of the ozone concentration and radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

2.3最佳工艺参数的确定于模型验证

在相对湿度为90%±5%，根据回归方程预测及响应面分析结果，由软件分析得出臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌效果的最佳工艺条件为：辐射距离30.79cm、处理时间31.84min、臭氧浓度31.18mg/m3，理论杀菌率为100%。考虑到实际操作问题，最终确定臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌效果的的最佳工艺条件为：辐射距离31cm、处理时间32min、臭氧浓度31mg/m3。以此条件进行3组平行验证实验，测得枸杞干果的杀菌率为99.999%，与理论值基本一致，说明方程与实际情况拟合较好，所建模型适用于研究臭氧与紫外复合处理对枸杞干果杀菌效果的影响。

2.4枸杞干果微生物降解前后品质变化测定

通过响应面优化出的最佳工艺条件：辐射距离31cm、处理时间32min、臭氧浓度31（mg/m3）以此条件进行3组平行实验，测定臭氧与紫外复合处理前后的枸杞干果的品质指标，见表4。

表4　处理前后枸杞干果品质指标Table 4　The quality indexes of dried Lycium barbarum L.before and after processing

处理后灰分总糖、蛋白质、脂肪减少，水分的变化最大且处理后的水分增加，由于本实验在相对湿度90%±5%的环境中进行的，枸杞容易吸潮，所以导致水分增加，但仍在枸杞干储存范围内，经方差分析可知处理前后各理化指标均无明显差异，且微生物指标都在国家标准范围内。

3　结论

本研究以臭氧与紫外复合处理枸杞干果，使用SPSS软件和Design Expert软件分析确定出臭氧与紫外复合处理枸杞干果杀菌效果的最佳工艺条件为：辐射距离31cm、处理时间32min、臭氧浓度31mg/m3，在此条件下实际测得臭氧紫外复合杀菌率为99.999%，菌落总数和大肠菌群数均在国家标准范围之内；臭氧与紫外复合处理对枸杞干果品质无显著影响，处理后的干果品质均在枸杞子进出口标准范围之内，表明臭氧紫外复合作用在杀灭菌方面具有一定的优势，为枸杞的安全性、可食性开辟了一条新的道路。

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Optimization of ozone and ultraviolet combined on dried Lycium barbarum L.sterilization process by response surface methodology

GONG Yuan1，LIU Dun-hua2，*，QU Yun-qing3，LIAO Ruo-yu3，XU Meng-xia3
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Ozone and ultraviolet combined on Lycium barbarum L.dry fruit sterilization process.Sterilization process conditions were further optimized using response surface methodology as follow：radiation distance 31cm，processing time 32min，the ozone concentration 31mg/m3，for this condition，the sterilizing efficiency of ozone and ultraviolet combined on Lycium barbarum L.could be 99.999%.The quality of Lycium barbarum L.dry fruit did not change significantly after treatment under optimum conditions（p＞0.05）.This result indicating that the compound effects of ozone and ultraviolet had a certain advantages in terms of sterilization and provided scientific data and effective technical means for microbes degradation of Lycium barbarum L.Ningxia.

Lycium barbarum L.；ozone and ultraviolet combined；sterilization efficiency

TS255.36

B

1002-0306（2015）12-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.045

2014－10－30

龚媛（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。

刘敦华（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品质量与安全。