超临界CO2萃取长裙竹荪总黄酮的工艺优化及抗氧化研究

许　远，魏和平，*，操璟璟

（1.安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011；2.安庆师范学院资源与环境学院，安徽安庆246011）

超临界CO2萃取长裙竹荪总黄酮的工艺优化及抗氧化研究

许远1，魏和平1，*，操璟璟2

（1.安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011；2.安庆师范学院资源与环境学院，安徽安庆246011）

通过单因素实验探讨了萃取温度、CO2流量、萃取压力、萃取时间、夹带剂用量、分离试剂种类及用量对长裙竹荪总黄酮得率的影响，并采用响应面分析法确定超临界CO2萃取长裙竹荪总黄酮的最佳工艺条件为：萃取温度40℃，CO2流量10L/h，萃取压力35.5MPa，萃取时间122min。在此条件下，添加2∶1（V∶m）的95%乙醇作为夹带剂，以1∶4（V∶V）的石油醚对粗提物进行分离纯化，得到的长裙竹荪总黄酮得率可达3.6mg/g。抗氧化实验表明，长裙竹荪提取物有很好的还原性，对超氧阴离子（O2-·）、DPPH·和羟基自由基都有较好的清除能力，具有良好的抗氧化性。

长裙竹荪，总黄酮，超临界CO2，响应面分析法，抗氧化

竹荪（Dictyophpra spp.），又名竹参、纱网菌、竹姑娘等，隶属鬼笔科（Phallaceae）竹荪属（Dictyophora），是一类名贵大型食用真菌，素有“真菌皇后”、“山珍之王”等美称，历代列为贡品，亦是现代食疗佳品［1］。我国拥有竹荪属12种中的7个，研究集中在长裙竹荪、短裙竹荪、红托竹荪和棘托竹荪四个种，结果显示，竹荪中含有天然的21种氨基酸、各种维生素和微量元素、多糖等多种生物活性物质，尤以VB2含量较高［2］。

在竹荪活性物质的研究中，多糖提取相对较多，徐耀［3］针对红托竹荪不同部位多糖提取工艺及体外抗氧化活性进行了研究，结果显示其菌托中多糖含量达10.89%且抗氧化性最强。林玉满［4］对长裙竹荪多糖Di-S2P进行了进一步分离纯化，结果表明该多糖为均一组分，含有D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和D-木糖，摩尔比为1.62∶1.87∶1.00∶0.93。而针对竹荪黄酮类化合物的研究较少，萃取工艺及抗氧化性研究尚未见报道。黄酮类化合物是广泛存在于植物中的次生代谢产物［5］，具有抗菌、抗肿瘤、抑制脂质过氧化、防止毛细管渗透、镇痛、抗氧化和清除自由基等多种生物活性功能［6-7］，对抑制全球日渐蔓延的“高能量、高蛋白、高脂肪”饮食结构带来癌症、心血管等多种疾病，有显著疗效［8］。超临界萃取技术是20世纪70年代迅速发展起来的一种新型分离技术，与传统方法相比，具有萃取率高、分离效率好等特点，且萃取物可保持天然性质、无毒、无残留［9］，以临界温度低的CO2（31.6℃）作为流体溶剂，特别适合于食品工业生物活性物质和热敏性物质的分离提取［10］。本文通过超临界CO2萃取法对长裙竹荪子实体进行总黄酮测定，并采取响应面分析方法对其提取工艺进行优化，同时对其抗氧化性进行研究，旨在为进一步开发利用竹荪黄酮类化合物提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

长裙竹荪子实体市售，以粉碎机粉碎，过60目筛，制成干粉，储存于冰箱（0～4℃）备用；芦丁标准品（＞98%） 合肥博美生物科技有限责任公司；DPPH·（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）Sigma公司；CO2（＞99%，食品级） 安庆凯美特气体有限公司；盐酸、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、抗坏血酸、硝酸铝、邻苯三酚、Tris、水杨酸、三氯乙酸、铁氰化钾、硫酸亚铁、三氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等均为分析纯。

HA121-50-05超临界CO2萃取装置江苏南通华安超临界萃取有限公司；手提式多功能粉碎机上海广沙工贸有限公司；UV759紫外可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司；FA2004B电子天平上海越平科学仪器有限公司；DZ-2BCⅡ真空干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司；HHS电热恒温水浴锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂；RE-2000旋转蒸发器上海洪旋实验仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司；SC-3612低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线绘制采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法［11］，精密称取105℃真空干燥至恒重的芦丁标准品6mg，以70%乙醇溶解并定容至10mL，摇匀，得0.6mg/mL的芦丁标准液。准确吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL上述标准液分别置于10mL的容量瓶中，加2～4mL蒸馏水，加0.4mL 5%亚硝酸钠，摇匀，放置6min，加入0.4mL 10%硝酸铝，摇匀，放置6min，加入4.0mL 4%氢氧化钠，再加蒸馏水至刻度、摇匀，放置15min，以空白试剂作对比参照，在510nm处测定吸光度，得标准曲线回归方程：

A=4.17C+0.342

式中，A—吸光度，C—芦丁浓度（mg/mL）。

R2=0.996，0～0.3mg/mL之内，A与C之间存在良好的线性关系。

1.2.2长裙竹荪黄酮的提取准确称取100.0g竹荪干粉装入萃取釜，以一定量95%乙醇为夹带剂，按实验方案设定萃取温度、CO2流量和萃取压力，固定分离釜Ⅰ压力8MPa，温度40℃，分离釜Ⅱ压力6MPa，温度45℃，萃取至实验设定时间，每隔30min收集萃取物，合并后按一定比例加入分离试剂，搅匀后静置30min，取上清液减压抽滤浓缩，测定滤液体积。取2mL上述滤液于10mL容量瓶中，按项1.2.1的方法，在510nm处测定其吸光度，并通过标准曲线计算竹荪总黄酮得率，重复三次，取平均值，计算公式如下：

长裙竹荪总黄酮得率（mg/g）=C×V1×V/V2×m

式中，C—提取液中总黄酮浓度（mg/mL）；V1—显色时定容体积（mL）；V2—显色时取样体积（mL）；V—提取液总体积（mL）；m—原料质量（g）。

1.2.3单因素实验以萃取温度、CO2流量、萃取压力、萃取时间、夹带剂用量、分离试剂用量六个因素为研究对象，以竹荪总黄酮得率为指标，进行单因素实验。各因素取值水平见表1。

表1　单因素取值水平Table 1　Levels and factors

1.2.4响应面法对提取工艺参数的优化为分析各影响因素间的交互作用对竹荪总黄酮得率的影响，在单因素实验结果的基础之上，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，运用Design Expert 8.0软件进行响应面实验设计，分别选择萃取温度（A）、CO2流量（B）、萃取压力（C）、萃取时间（D）作为自变量，以竹荪总黄酮的得率（R）作为响应值设计响应面实验，因素水平取值见表2。

1.2.5竹荪总黄酮抗氧化性实验在响应面实验结果得出的最佳提取条件下获得竹荪总黄酮提取液，进行总还原能力、DPPH·自由基、超氧阴离子（O2-·）、羟基自由基（·OH）三者清除能力的测定，分别将提取浓缩液配制成不同浓度梯度的待测溶液，均以抗坏血酸（VC）为对照，比较结果确定其抗氧化能力。

表2　响应面设计因素和水平Table 2　Levels and factors of response surface analysis

1.2.5.1总还原能力的测定参照莫开菊等测定生姜黄酮总还原力的方法［12］。

1.2.5.2DPPH·自由基清除率的测定参照胡迎芬等测定月季花提取物DPPH·自由基清除率的方法［13］。

1.2.5.3超氧阴离子（O2-·）清除率的测定参照贺文英等测定苦豆籽粕总黄酮对超氧阴离子（O2-·）清除率的方法［14］。

1.2.5.4羟基自由基（·OH）清除率的测定参照程超等测定平菇多糖对羟基自由基（·OH）清除率的方法［15］。

1.3数据处理

采用Microsoft Excel（Office 2003）软件整理数据，Design Expert 8.0软件进行数据分析。

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1萃取温度的选择由图1可知，在本研究中，随着萃取温度的升高总黄酮得率先上升，达到40℃后呈略下降趋势。原因可能是：一方面，温度升高能提高物料的扩散系数，有利于溶质溶出；另一方面，温度升高又降低了CO2浓度，导致其溶解能力降低不利萃取。萃取温度是超临界CO2流体萃取过程重要参数之一，对于萃取率影响较为复杂，升温有可能造成萃取率增加、不变或降低，决定于升温所降低的超临界流体密度与增加的扩散系数两种竞争效应相持的结果。因此，在实验与实际生产中，要力求找到平衡两个方面的最适萃取温度［16］。故萃取温度选用35～45℃进行响应面实验分析。

图1　萃取温度对总黄酮得率的影响Fig.1　Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.1.2CO2流量的选择由图2可知，CO2流量在4～ 14L/h之间得率先增后减，几乎呈抛物线趋势。原因可能是：一方面流量增加，其传质系数和接触面积都相应增加而促进了流体的溶解能力，利于萃取；另一方面流量过大，将使溶质与流体接触不充分，有效成分萃取受限，流体耗量增加且生产成本增高，甚至会导致萃取物被吹入测定流量的软管中而造成损失，使得率进一步降低。故CO2流量选用8～12L/h进行响应面实验分析。

图2　CO2流量对总黄酮得率的影响Fig.2　Effect of CO2flow rate on extraction rate of total flavonoids

2.1.3萃取时间的选择由图3可知，随着萃取时间的增加，得率升高，但当时间超过90min后得率上升趋于平缓。随着萃取时间的延长，超临界CO2流体与物料接触越充分，萃取越完全，萃取得率也就越高。但至120min后黄酮基本溶出，继续延长萃取时间，对于得率影响不大，且会增加生产成本。故萃取时间选择90～150min进行响应面实验分析。

2.1.4萃取压力的选择由图4可知，随着压力的升高，得率增大，至35MPa后稍有下降。不同化合物在不同的超临界流体压力下的溶解度存在差异［17］。超临界流体的密度增加，溶质与溶剂之间的传质效率增加，使细胞内的物质更容易传递到细胞的表面，使萃取更完全；当压力增大到一定程度时，继续增加压力，超临界流体的黏度增加，使得流体的传质速率下降，影响萃取效果，且增大压力也增加了成本和不安全因素。故萃取压力选择30～40MPa进行响应面实验分析。

2.1.5夹带剂用量的选择由图5可知，随着夹带剂用量的增加，得率呈上升趋势，达到2∶1后增幅减弱。黄酮类化合物在超临界CO2流体中的溶解度极低，添加夹带剂可达到增大其溶解度的目的，95%乙醇是常用的夹带剂之一。但用量达到2∶1后，黄酮基本溶出，再增加对于得率影响不大，故夹带剂用量选择2∶1（V∶m，mL/g）进行实验。

图4　萃取压力对总黄酮得率的影响Fig.4　Effect of extraction pressure on extraction rate of total flavonoids

图5　夹带剂用量对总黄酮得率的影响Fig.5　Effect of entrainer volumes on extraction rate of total flavonoids

2.1.6分离试剂种类及用量采用超临界CO2萃取出的黄酮类化合物含有醇溶性的绿原酸、花青素、鞣酸及其酚类成分，因此需对粗提物进行分离纯化，以提高黄酮类化合物的纯度［18］。由图6可知，不同种类溶剂分离纯化对于黄酮得率影响较大，石油醚分离纯化后的得率最高，可能是由于竹荪黄酮类化合物的极性与石油醚极性最为接近，反之与蒸馏水极性最远。同时，随着试剂用量的增加，均呈增长的趋势，但都增幅平缓，结合操作成本需求，选择V∶V=1∶4比例的石油醚做分离试剂。

2.2响应面法确定竹荪总黄酮的最佳提取条件

2.2.1响应面法实验设计及结果选择萃取温度（A）、CO2流量（B）、萃取压力（C）、萃取时间（D）作为自变量，以竹荪总黄酮得率（R）作为响应值设计响应面实验，结果见表3。

图6　分离试剂种类及用量对总黄酮得率的影响Fig.6　Effect of types and amounts of separation solvents on extraction rate of total flavonoids

表3　响应面实验结果Table 3　Results of response surface design

利用Design Expert 8.0软件对表3的数据进行多元回归分析，拟合后得到A、B、C、D的二次多项回归模型为：

R=0.92027A+1.36375B+0.46090C+0.080967D-2.75000E-003AB-1.30000E-003AC-6.66667E-005AD+5.00000E-004BC+7.91667E-004BD+ 4.00000E-004CD-0.010403A2-0.0066271B2-6.55333E-003C2-4.19815E-004D2-35.06308

对上述方程进行方差分析，结果如表4所示。

结果显示，模型显著性检验p值＜0.0001，达极显著水平，表明各因素自身交互作用影响显著。失拟项p值为0.3131＞0.05，说明拟合度良好，其相关系数R2= 0.9981，校正决定系数R2Adj=0.9963，说明该模型实验误差小，能充分反映出各因素与响应值之间的关系，因此，可以用该方程对实验结果进行分析。

表4　回归模型方差分析Table 4　Variance analysis of regression model

模型的一次项A、B、D为极显著，C为显著；二次项A2、B2、C2、D2为极显著；交互项BD、CD为极显著，AB、AC为显著，AD、BC不显著，由此可知，自变量与响应值之间不是简单的线性关系。通过F值可知，各单因素对竹荪总黄酮得率的影响程度依次为：B＞D＞A＞C；各两因素交互作用对竹荪总黄酮得率的影响程度依次为：CD＞BD＞AC＞AB＞AD＞BC。

2.2.2响应面分析图7（a～f）直观反映了各因素间交互作用对长裙竹荪总黄酮得率的影响。由图7可知，萃取压力和萃取时间，CO2流量和萃取时间交互作用最显著，萃取温度和萃取压力、萃取温度和CO2流量次之，萃取温度和萃取时间、CO2流量和萃取压力最不显著，此结果与模型中F值分析结果一致。

2.2.3条件优化最佳提取工艺理论值是萃取温度40.27℃，CO2流量10.32L/h，萃取压力35.45MPa，萃取时间121.87min，在此条件下模型预测竹荪总黄酮得率为3.6065mg/g。考虑到实际操作的便利，将长裙竹荪总黄酮提取的最佳工艺条件修正为：萃取温度40℃，CO2流量10L/h，萃取压力35.5MPa，萃取时间122min。按照修正后的条件下进行3次验证实验，结果分别是3.59、3.62、3.60mg/g，取其平均值为3.6mg/g，与预测值3.6065mg/g接近，RSD值为0.42%，说明回归方程能较好地反映各因素对总黄酮得率的影响，证明该回归模型是可靠的。

2.3抗氧化实验的结果分析

2.3.1总还原能力由图8可见，竹荪总黄酮样品的还原能力随浓度的增大呈上升趋势，30μg/mL时已较接近VC还原能力，表明其具有非常强的还原力。

2.3.2清除DPPH·自由基由图9可见，VC清除DPPH·自由基能力较强，15μg/mL时清除率已达95.32%，继续增大浓度后清除率无显著变化，竹荪总黄酮样品对DPPH·自由基的清除能力随浓度的增大呈明显增长趋势，25μg/mL时清除率已超过50%，可见其对DPPH·自由基有很强的清除能力。

2.3.3清除超氧阴离子（O2-·） 由图10可见，VC对超氧阴离子（O2-·）有极高的清除能力，0.6mg/mL后清除率几乎达到100%，而竹荪总黄酮样品对超氧阴离子（O2-·）的清除能力随浓度增加而不断增强，且浓度在0.4mg/mL后，曲线增幅明显，表明其对超氧阴离子（O2-·）具备较强的清除能力。

2.3.4清除羟基自由基（·OH）由图11可见，VC在0.3～0.7mg/mL的浓度范围内，对羟基自由基（·OH）始终保持很高的清除能力，清除率几乎达到100%，竹荪黄酮样品在低浓度时对羟基自由基（·OH）的清除能力与VC相差较多，但随着浓度的上升，其清除能力显著增强，在0.7mg/mL时清除率达到90.1%，表明其对羟基自由基（·OH）有较强的清除能力。

3　结论

利用超临界CO2流体技术萃取长裙竹荪总黄酮的最佳提取工艺为：添加2∶1（V∶m）的95%乙醇作为夹带剂，设定萃取温度40℃，CO2流量10L/h，萃取压力35.5MPa，萃取时间122min，然后以1∶4（V∶V）的石油醚对粗提物进行分离纯化，长裙竹荪总黄酮得率可达3.6mg/g，结果具有良好的重复性。

图7　各因素对总黄酮得率影响的响应面分析Fig.7　Responsive surface plot for the effect of factors

图8　样品与VC还原能力比较Fig.8　Comparison of reducing power on sample with VC

图9　样品与VC清除DPPH·自由基能力比较Fig.9　Comparison of DPPH·radical scavenging activity on sample with VC

图10　样品与VC清除超氧阴离子（O2-·）能力比较Fig.10　Comparison of superoxide radical scavenging activity on sample with VC

图11　样品与VC清除羟基自由基（·OH）能力比较Fig.11　Comparison of hydroxyl radical scavenging activity on sample with VC

抗氧化实验证明，长裙竹荪总黄酮具有很好的还原能力，对于自由基具有较好的清除能力，对DPPH·自由基和羟基自由基（·OH）具有很强的清除能力，对于超氧阴离子（O2-·）也具有一定的清除能力，抗氧化效果表现良好。

研究表明长裙竹荪中黄酮类化合物含量较高，具有一定的开发利用前景。本研究结果为更深层次研究竹荪黄酮类化合物提供技术支持。

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Study on optimization of extraction of total flavonoids from Dictyophora indusiata Fisch.by supercritical CO2and its antioxidant activity

XU Yuan1，WEI He-ping1，*，CAO Jing-jing2
（1.School of Life Sciences，Anqing Normal University，Anqing 246011，China；2.School of Resources and Envionment，Anqing Normal University，Anqing 246011，China）

The effect of extraction temperature，CO2flow rate，extraction pressure，extraction time，entrainer volumes，types and amounts of separation solvents on the extraction yield of total flavonoids from Dictyophora indusiata Fisch.was investigated by single factor test in this study.The supercritical CO2extraction conditions were further optimized by the response surface analysis and were determined to be extraction temperature of 40℃，CO2flow rate of 10L/h，extraction pressure of 35.5MPa and extraction time of 122min.Under the optimal extraction conditions，the yield of total flavonoids from Dictyophora indusiata Fisch.reached 3.6mg/g by adding 2∶1（V：m）95%ethanol and then adding 1∶4（V∶V）petroleum ether.Result of antioxidation showed that the total flavonoids from Dictyophora indusiata Fisch.had good total reduction capabilities，and scavenging hydroxyl radicals，DPPH，superoxide anion（O2-·），it had good antioxidant activity.

Dictyophora indusiata Fisch.；total flavonoids；supercritical CO2；response surface methodology；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0204-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.035

2015－02－05

许远（1981-），女，硕士，讲师，研究方向：天然产物研究与开发。

魏和平（1964-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物研究与开发。

安徽省高等学校优秀青年人才基金重点项目（2013SQRL060ZD）；安庆市重点科技项目（20101008）。