复方功能制剂对改善小鼠记忆功能的影响

罗丽华，杨昌林，杜　鹏，张　琳，王若永，李　彤，穆慧玲（.空军航空医学研究所，北京004；.东北林业大学，黑龙江哈尔滨50040）

复方功能制剂对改善小鼠记忆功能的影响

罗丽华1，杨昌林1，杜鹏1，张琳2，王若永1，李彤1，穆慧玲1
（1.空军航空医学研究所，北京100142；2.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040）

为研究牛磺酸、咖啡因、人参皂甙复方功能制剂在改善记忆方面的功能，选取雄性昆明小鼠40只，随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。低、中、高剂量组每天分别灌胃给予复方功能制剂41、80和237 mg/kg BW，空白对照组每天灌胃给予同体积的蒸馏水，共灌胃30 d。末次灌胃后次日将4组小鼠按跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、Morris水迷宫实验顺次进行实验，比较组间各项观察指标的差异。研究结果表明，中、高剂量组跳台实验记忆巩固潜伏期显著延长（p＜0.05），低、中、高剂量组穿梭实验不同训练周期的主动/被动回避时间、水迷宫实验的对位探查实验均有显著性差异（p＜0.05）。提示本复方功能制剂能显著改善小鼠的学习记忆能力，具有改善记忆功能。

牛磺酸，咖啡因，人参皂甙，记忆，改善记忆功能

记忆是一个极其复杂的心理、生理和生化过程，涉及神经营养、突触形态和功能、中枢神经递质及受体、Ca2+浓度、细胞凋亡及相关基因表达、信号转导等改变。近年来，国内外对改善记忆功能进行了大量的研究，结果表明多种氨基酸、多不饱和脂肪酸、微量营养素及多种植物化学物等均具有改善记忆的生物学作用，如牛磺酸、人参皂甙、咖啡因、鱼油、卵磷脂、酪氨酸、锌等［1-5］，单一功能成分或复方制剂均有改善记忆的功能［6-7］。牛磺酸是中枢神经系统含量丰富的游离氨基酸，可通过多种渠道来影响认知功能［8］；人参皂甙是我国传统的滋补养生名贵药材人参的主要功效成分，长期临床实践证明人参皂甙具有多靶点、多环节综合促进学习记忆的作用［9］；而咖啡因是目前世界上使用最广泛的精神兴奋性类物质，具有兴奋心脏、骨骼肌和中枢神经系统以及抗氧化、舒张血管、松弛平滑肌等生理作用，对维持警醒、缓解疲劳具有显著作用［10-13］。三种功能成分均具有效果明确、疗效显著、食用安全等特点。为进一步探讨该功能成分的协同效应，研制一种安全、高效的改善记忆功能制剂，本研究优选牛磺酸、咖啡因、人参皂甙作为功效成分进行组方，按照国家卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）［14］要求，采用小鼠记忆实验模型，对其改善记忆功能进行研究，以期为研制改善认知和记忆的功能食品打下基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

复方功能制剂由空军航空医学研究所营养与特种食品研发中心研制；牛磺酸（浓度99.56%）、咖啡因（浓度98.96%）及人参皂苷（浓度80.31%） 均购于上海融禾医药科技发展有限公司。

YLS-3TB型跳台记录仪、YLS-17B型避暗穿梭测试仪济南益延科技发展有限公司；XR-XR101型Morris水迷宫、XR-Xmaze型动物行为分析软件上海欣软信息科技有限公司。

1.2实验动物及分组

昆明小鼠40只，体重（20±2）g，雄性。饲养环境为全屏障清洁级动物实验室，温度（22±2）℃，相对湿度（50%±5%），12～12 h光照及黑暗环境循环。喂饲全价营养颗粒饲料。实验动物和饲料均由吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。实验动物合格证号0021281，实验动物使用许可证号SCXK-（吉）2011-0004。实验前适应性饲养3 d。

将实验用小鼠按体重随机分为4组：低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白对照组，每组10只。实验前夜禁食不禁水。按照人体推荐量咖啡因300 mg/人·日、牛磺酸200 mg/人·日、西洋参总皂苷50 mg/人·日，以标准人体重为70 kg进行换算，计算得出相当于人体推荐量的5倍为低剂量组、10倍为中剂量组、30倍为高剂量组，每天分别灌胃给予牛磺酸、咖啡因和人参皂甙复方制剂41、80和237 mg/kg BW，空白对照组每天灌胃给予同体积的蒸馏水，共灌胃30 d。

表1　小鼠跳台实验记忆获得与巩固的结果Table 1　Results of memory acquisition and consolidation in mice from step down test

1.3实验方法及检测指标

受试样品给予时间为30 d，给药第1 d称量小鼠体重一次，根据体重按0.4 mL/20 g折算成给药体积，之后每7 d称量一次，根据体重的变化调整给药体积。根据国家卫生部颁发的《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）［14］方法将4组小鼠按跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、Morris水迷宫实验顺次进行实验，比较组间各项指标的差异。

1.3.1跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）［14］。

1.3.2Morris水迷宫实验参照《保健食品功能范围调整方案（2011年8月上网征求意见稿）》［15］中新的水迷宫方法Morris水迷宫实验进行，新标准中未描述新方法的实验步骤和检测指标，本实验内容参照Morris水迷宫生产厂家提供的实验方法进行实验。将水池分为4个象限，平台置于其中一个象限区的中央。将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。在前几次训练中，如果在60 s内未找到平台，则引导小鼠到平台，停留10 s。获得性训练分3 d进行共16次（第1 d 4次，第2、3 d每天6次，每次训练之间间隔5～10 min）。最后一次获得性训练结束后第2 d，开始探查训练。将平台撤除，开始60s的探查训练。将小鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录小鼠进入目标象限（原放置平台的象限）所花时间和次数。

在探查训练结束后第2 d，开始3 d的对位训练。即将平台放在原平台所在象限的对侧象限，方法与获得性训练相同。最后一次对位训练的第2 d进行对位探查训练，方法同探查训练。记录小鼠60 s内进入目标象限（平台第二次所在区）所花时间和进入该区的次数。

1.4数据处理与统计分析

每个处理重复2次，通过SAS 9.20软件计算平均值和标准差并进行统计分析。首先进行方差齐性检验（F检验），方差齐，用T检验进行统计；方差不齐，用秩和检验进行统计。跳台实验、避暗实验错误次数和动物数用χ2检验进行统计。以p＜0.05为差异性显著，p＜0.01为差异性非常显著。

表2　小鼠跳台实验记忆再现-消退实验结果Table 2　Results of memory retrieval-extinction in mice from step down test

2　结果与分析

2.1复方功能制剂对小鼠跳台实验的影响

由表1和表2可知，记忆巩固实验中、高剂量组与对照组比较，潜伏期明显延长，具有显著性差异（p＜0.05）。其他结果未见显著统计学差异。小鼠跳台实验是测量改善实验动物记忆的常用实验方法。实验结果中，中、高剂量组小鼠记忆巩固潜伏期明显延长，说明小鼠记忆保持时间增加，提示中、高剂量组的复方功能制剂对小鼠记忆巩固过程有促进作用。

2.2复方功能制剂对小鼠避暗实验的影响

结果见表3和表4。避暗实验中，记忆获得和记忆再现-消退实验各实验组均未见显著性差异。

表3　小鼠避暗实验记忆获得与巩固的结果Table 3　Results of memory acquisition and consolidation in mice from step through test

表4　小鼠避暗实验记忆再现-消退的结果Table 4　Results of memory retrieval-extinction in mice from step through test

表5　小鼠穿梭实验主动/被动回避时间的结果Table 5　Results of the active and passive evading time in mice from shuttle box test

2.3复方功能制剂对小鼠穿梭实验的影响

由表5可知，低剂量组与对照组比较，第3 d训练的主动/被动回避时间显著缩短（p＜0.05）；中剂量组与对照组比较，在第1 d和第3 d训练的主动/被动回避时间显著缩短（p＜0.05）；高剂量组与对照组比较，在第3 d训练的主动/被动回避时间显著缩短（p＜0.05）。

表6　小鼠水迷宫实验探查和对位探查实验结果Table 6　Results of the exploring and counterpoint exploring time in mice from water maze test

穿梭实验可用于检测实验动物记忆改善情况。与对照组比较，低、高剂量组在第3 d、中剂量组在第1 d和第3 d的主动/被动回避时间均有显著性差异（p＜0.05），提示低、中、高剂量组的复方功能制剂对小鼠记忆均有一定的改善作用。

2.4复方功能制剂对小鼠Morris水迷宫实验的影响

Morris水迷宫是一种研究与海马功能直接相关的空间学习记忆模型，能较准确地反映动物的空间学习记忆能力。由表6可知，在对位探查实验中，低、中、高剂量组与对照组比较，对位探查实验有显著性差异（p＜0.05），其中中剂量组60 s内进入目标象限次数显著增加（p＜0.05），提示低、中、高剂量组的复方功能制剂能明显地提高小鼠的空间辨别能力或空间辨别的记忆再现能力。

3　结论

小鼠跳台实验、避暗实验、穿梭实验以及Morris水迷宫是常用的研究记忆改善功能的动物实验。本研究采用上述四项实验，结果表明，低剂量组穿梭实验、水迷宫实验结果阳性，中剂量组跳台实验、穿梭实验、水迷宫实验结果均为阳性，高剂量组跳台实验、穿梭实验、水迷宫实验结果均为阳性。提示牛磺酸、咖啡因、人参皂甙复方功能制剂对小鼠的学习记忆功能有明显改善作用。

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Effect of the compound preparation on improving the memory of mice

LUO Li-hua1，YANG Chang-lin1，DU Peng1，ZHANG Lin2，WANG Ruo-yong1，LI Tong1，MU Hui-ling1
（1.Institute of Aviation Medicine，Air Force，Beijing 100142，China；2.Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

This study was designed to evaluate effects of taurine，caffeine and ginsenosides compound preparation on improving the memory of mice.Forty Kunming male mice were randomly divided into four groups，including groups of low-dosage，medium-dosage，high-dosage and control（each with n=10）.The low，medium and high dosage groups were given 41，80 and 237 mg/kg BW of compound preparation respectively through intragastric intubation daily for 30 days.The control group was given the same volume of distilled water at the same time.Experiments of step-down test，step through test，shuttle box test and Morris water maze test were conducted in order after the last intubation.The differences between each group were compared.Results indicated that the memory consolidation latent period of medium and high dosage groups were prolonged significantly in step down test（p＜0.05）.In shuttle box test，the active and passive evading time of the low，median and high dosage groups in all training cycles shortened（p＜0.05）.In water maze test，the counterpoint exploring time also were shortened（p＜0.05）.In conclusion，the compound preparation could improve significantly the learning and memory ability of mice.The results indicated that the compound preparation had memory improving effect.

taurine；caffeine；ginsenosides；memory；memory improving effect

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0367-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.066

2014－08－15

罗丽华（1964-），女，硕士，研究员，研究方向：营养与功能食品，E-mail：lll333@sina.com。

“十二五”全军后勤科研重点项目（BX111C017）。