蛋白质表达谱在选择性COX-2抑制剂中抗癌作用的机制研究

朱天吉，张　卿

（内蒙古医科大学附属医院呼吸内科，内蒙古呼和浩特010050）

·基础与转化医学·

蛋白质表达谱在选择性COX-2抑制剂中抗癌作用的机制研究

朱天吉，张卿

（内蒙古医科大学附属医院呼吸内科，内蒙古呼和浩特010050）

目的：为了确定蛋白质表达谱在选择性COX-2抑制剂尼美舒利（NIM）抗肺癌的作用，本研通过运用二维凝胶电泳，质谱分析和生物信息学技术研究尼美舒利对肺癌蛋白质表达的影响，分离并鉴定其相关蛋白质.方法：建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型并进行尼美舒利药物干预，应用双向电泳技术对尼美舒利组和对照组的裸鼠移植瘤的总蛋白进行分离，利用PDQUEST7.2软件分析差异蛋白质点，并进行质谱鉴定.结果：通过双向电泳-图像分析-质谱技术确定了14个差异蛋白质点，其中11个蛋白质在尼美舒利组显著下调，3种蛋白质显著上调.结论：质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质对确定尼美舒利抗肺癌作用的机制有一定指导意义，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定良好的基础.

肺腺癌；裸鼠移植瘤；蛋白质组学；质谱分析

0 引言

相关资料显示，肺癌无论是年发病率还是年死亡率，均居全球癌症首位.过去生物学和医学对于癌症的研究主要集中在基因水平和转录水平，而肿瘤是由环境因素和遗传因素相互作用的多种基因和蛋白质参与的疾病，是由某些蛋白质的表达或者变化引起的一系列细胞无限增殖过程，所以蛋白质对于肿瘤的研究至关重要［1-2］.蛋白质组是指一个组织、细胞或基因组在一个时期内所表达的所有蛋白质，蛋白质组学就是对这些蛋白质进行研究的学科，它最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年提出的［3］.蛋白质组学的提出为我们研究肿瘤发生和治疗的分子机制提供了新的思路.

本研究以尼美舒利（nimesulide，NIM）干预肺腺癌A549细胞接种的裸鼠移植瘤为研究对象，采取比较蛋白质组学的研究技术，以双向凝胶电泳分离蛋白质，用图像分析技术寻找差异表达的蛋白质，并进行质谱鉴定，筛定出尼美舒利干预后肺腺癌裸鼠移植瘤中的差异蛋白质，为研究肺癌的发生、转移机制及治疗提供线索和依据.

1 材料和方法

1.1细胞株及实验动物 人腺癌细胞株A549购自南京博尔生物有限公司.实验动物BALB-C裸鼠，共20只，雌性，4～6周，购自中国医学科学院实验动物研究所，层流净化室内饲养，接种前体质量18～20 g.

1.2实验试剂 RPMI-1640培养基：购自德国Applichem公司；胎牛血清：GIBCO公司；胰蛋白酶：GIBCO公司产品；二甲基亚砜（DMSO）分析纯：Sigma公司；青霉素、链霉素：华北制药有限公司；PBS缓冲液：南京博尔迪生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC）：河北省大城县新丰纤维素厂；尼美舒利（Nimesulide，NIM）：Sigma公司；蛋白定量试剂盒：碧云天生物技术研究所；2-D Clean-up Kit试剂盒：GE Healthcare Bio-Sciences公司；IPG Buffer：GE Healthcare Bio-Sciences公司；IPG胶条（pH3～10，线性，13 cm）：GE Healthcare Bio-Sciences公司.

1.3细胞培养及裸鼠成瘤 用含10％胎牛血清、100 u/mL青霉素及链霉素的RPMI-1640培养基将肺腺癌A549细胞培养于37℃，5％CO2培养箱.取对数生长期的肺腺癌A549细胞，以108个/mL密度悬于PBS中.每只裸鼠皮肤消毒后将1 mL PBS细胞悬浮液接种于左侧背部皮下.将裸鼠随机分为对照组（n=10）和实验组（尼美舒利组，n=10），实验组每天每只给予0.2 mL尼美舒利60 mg/0.2 mL·kg-1溶于5％CMC灌胃，对照组给予0.2 mL0.5％羧甲基纤维素钠灌胃，用药21 d.21 d后断颈处死各组裸鼠，完整分离切下移植瘤.

应用双向电泳技术对尼美舒利组和对照组的裸鼠移植瘤的总蛋白进行分离，利用PDQUEST7.2软件分析差异蛋白质点，并进行质谱鉴定.将移植瘤组织置于-20℃预冷后的研钵中，在液氮条件下将组织研磨成精细粉末，置于1.5 mL的EP管中，加入裂解液（100 mg/500μL），同时加入1 mM PMSF（100 Mm PMSF，10μL）、2 mM EDTA（200 mM EDTA，10 uL），室温下静置至少1 h，冰浴超声前加入100 mM DTT 10μL，超声5 min（超1 s，隔2 s），-20℃条件下静置过夜.次日在4℃条件下，以20 000 g的离心力离心30 min，取上清液即为总蛋白质，然后用2-D Clean-up Kit试剂盒（按照试剂说明）纯化蛋白质，再用改良的Bradford法测蛋白质浓度后制成溶解样品即水化液（蛋白上样量650μg，液体量250μL）.将溶解样品移入标准性胶条阳极端，在IPG胶条上覆盖1 mL Immobiline Drystrip覆盖油，盖上盖子，将其尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触，饱胀和等电聚焦均在20℃下自动进行，水化11 h左右，加电压聚集，等电聚焦电泳结束后，用镊子夹住胶条的正极，用去离子水洗掉覆盖油，用滤纸吸净离子水，放入DTT平衡液的试管内，支持膜贴管壁，置摇床平衡10min，然后加入碘乙酰胺平衡液中，置摇床平衡15 min，去除多余的DTT，取出胶条后用SDS电极缓冲液冲洗胶条，再在Ettan DALTⅡ灌胶槽中制备2块PAGE胶，把胶条放在玻璃板之间的凝胶上，吸干电极缓冲液，用0.5％的琼脂糖封顶.垂直电泳在Ettan DALTⅡ电泳槽中进行，当运行溴酚蓝达到距胶条的底线1 cm时停止电泳.把二厢结束的胶进行固定、染色、固定、脱色，至蛋白质点清晰.利用Proxpress2D蛋白凝胶成像系统进行图像扫描，然后用PDQUEST7.2软件对扫描的图像进行分析，质谱鉴定在华大基因研究所完成.

2 结果

2.1成功构建人肺腺癌裸鼠移植瘤模型 接种肺腺癌A549细胞后，3 d左右开始成瘤，瘤体逐渐增大，成瘤率达100％.移植瘤呈圆形、卵圆形或结节型，初期瘤体表面光滑，但随着瘤体逐渐增大，部分瘤体表面破溃、结痂.移植瘤裸鼠生长状态良好，饮食及活动正常，无其他明显不良反应.

2.2双向电泳图谱 尼美舒利组和对照组各选定一块蛋白质点显示比较均匀、杂质斑点少、最能体现该组蛋白质分布状态的一块凝胶.差异蛋白质点的选择借助图像分析软件进行匹配，以所选的胶为基准，参考其他胶，选择组间表达差异明显、组内表达含量稳定、位置恒定的点作为目标点，发现其中有14个差异蛋白质点，11个蛋白质在尼美舒利组显著下调，其中5种蛋白质与肿瘤有关，它们是Rho GTPase、alpha-globin、beta-globin、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1、Serpin 9d，有1种蛋白质为unnamed protein product；3种蛋白质在尼美舒利组显著上调，它们是tropomyosin 1（TM1）、tropomyosin 2（TM2）和Myosin light chain 1（MLC1）（图1、图2）.

A：尼美舒利组；B：正常对照组图1　肺腺癌裸鼠移植瘤总蛋白双向电泳图谱

图2　经PDQuest软件分析获得的肺腺癌裸鼠移植瘤组织双向电泳差异蛋白

2.3差异蛋白质点的MALDI-TOP-TOP-MS肽质量指纹图谱分析 切取平行胶上14个相应的差异蛋白质点，经胶内原位酶解后用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪（MALDI-TOP-TOP-MS）分别对其肽指纹进行测定，并以酶自动降解（m/z=1993. 9772）进行校正，搜索数据库（http：//www.matrixcience. com/）鉴定得到这些差异蛋白的相关信息（表1）.

表1　差异蛋白的质谱分析结果

3 讨论

尼美舒利是有机酸类非甾体类消炎药，除临床上用于抗炎及风湿性疾病等的治疗外，已有众多的流行病学资料、体内外实验和临床研究表明尼美舒利具有防治肿瘤的作用［4-6］.目前非甾体类消炎药抗肿瘤作用分子机制的研究多处于基因水平，在蛋白质方面的研究较少，且多数是单个基因或蛋白质的研究，虽然调控生命活动的源头是基因，但蛋白质才是生命活动的具体执行者和体现者.蛋白质学的研究大致分为两类，一类是结构蛋白质组学研究，主要目的是查清人类基因所表达的全部蛋白质，建立蛋白质数据库，另一类是差异蛋白质组学研究，即通过寻找两个或多个样本之间蛋白质差异表达的因素，研究生物体的生理、病理过程及对外界的干扰因素发生反应的机制，也称为功能蛋白质组学研究.

为了研究选择性COX-2抑制剂尼美舒利抗肺癌作用的分子机理，本研究应用了功能蛋白质组学的方法，比较了尼美舒利与对照组肺癌裸鼠移植瘤的总蛋白双向电泳凝胶图谱，分析鉴定结果后获得了14个差异蛋白质点，11个蛋白质在尼美舒利组显著下调，其中5个与尼美舒利抗肿瘤作用相关，它们是：Rho GTPase、alpha-globin、beta-globin、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 Serpin 9d；3种显著上调，它们是tropomyosin 1（TM1）、tropomyosin 2（TM2）和Myosin light chain 1（MLC1），主要与肿瘤细胞增殖及转移有关.

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）属于微丝结合蛋白，具有稳定的微丝结构，参与微丝细胞粘附和凋亡信号转导的过程，TM合成降低可改变微丝结构，增加细胞运动、锚定非依赖性生长、以及抵制接触性抑制生长与转移有关的能力，导致细胞浸润和转移.在肿瘤细胞转移过程中，癌细胞首先从肿瘤中脱离下来，这一过程与细胞的运动分不开.可见，TM可能参与肿瘤形成和肿瘤转移过程.有报道认为TPM1和TPM2与膀胱癌有关［7］，也有研究发现，在非肌肉细胞中，TPM1发挥着细胞转化抑制的作用［8］，一旦TPM1受损或缺失，将导致细胞恶性转化，其异常表达是细胞离散的分子基础.Yi等［9］研究表明，COX-2抑制剂NS-398作用于子宫内膜癌细胞RL95-2，通过蛋白质组学分析显示有多种蛋白质表达，鉴定出上调的蛋白质中有tropomyosin，证明COX-2抑制剂NS-398通过tropomyosin的高表达抑制RL95-2细胞增殖、侵袭的能力.

肌球蛋白轻链1（fast skeletalmuscle isoform myosin light chain l，MLC1f），MLC是eukaryotic cells细胞骨架的结构组成部分，它对调节细胞形态、移动和生长发挥着重要的作用，Zhang等［10］的研究表明MLC1f抑制了细胞周期由G1期到S期，表明了MLC1有负面调整细胞增殖的作用，本研究中MLC1f在尼美舒利组表达明显上调，是否存在尼美舒利通过非COX-2依赖途径上调MLC1f来抑制肿瘤细胞的增值还需要证实.

近年来研究发现，Rho GTP酶在多种恶性肿瘤中高表达，并和肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关［11-12］.Rho GTP酶是细胞内多条信号转导通路的关键分子，作为分子开关在胞内信号转导中发挥桥梁作用.实验研究发现，在多种肿瘤中可见Rho GTP酶表达异常，改变细胞内Rho GTP酶的表达水平可以直接影响肿瘤细胞侵袭和转移的过程［12］.Chang等［13］研究发现，COX-2明显增加HCA-7细胞的Rho GTP酶的活性水平，COX-2激活了RhoA/Rho kinases（ROCK）通路，减低上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）和α-连环蛋白（α-catenin）水平，破坏了细胞连接形式及增加细胞运动.Takaoka等［14］研究表明，COX-2在细胞及组织内高表达，通过上调Rho GTPases，提高了致肿瘤性，促进肿瘤的生长季侵袭.

核不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1）是一种重要的RNA连接蛋白，是细胞核内hnRNP的基本核心成分.它在癌细胞和增殖的细胞中过度表达，可能是细胞癌变的原因之一［15］，hnRNP A2/B1在正常肺发育的关键阶段过度表达，表达水平与肺癌及癌前病变类似，其在成熟肺组织中的表达被抑制，在肺癌中的表达形式类似于胚肺生长中所见，这种表达形式在蛋白质和信号分子水平是一致的，显示hnRNP A2/B1可能是一种癌生长蛋白［16］，Sueoka等［17］对新鲜非小细胞肺癌组织进行了hnRNP A2/B1表达的研究，发现病变晚期组hnRNP A2/B1表达阳性率高于病变早期组.也有报道表明hnRNP A2/B1表达和肺癌分期及淋巴结转移密切相关［18］.

有研究表明选择性COX-2抑制剂通过诱导减少COX-2mRNA及其蛋白质表达的方式促进细胞凋亡［4］，而COX-2mRNA的3'-UTR区域能表达一种多聚体蛋白，这个多聚体蛋白包含HuR、TLA-1、TLAR和hnRNP［5］.尼美舒利抑制COX-2mRNA及其蛋白的表达，从而抑制hnRNPA2/B1的过量表达，抑制肺癌细胞的分化、浸润及转移.监测肺组织中hnRNPA2/B1表达有助于非小细胞肺癌的诊断，预测预后和指导多学科综合治疗.

本研究结果显示：①尼美舒利干预后裸鼠移植瘤组织中Alpha-globin、beta-globin、Serine proteinase inhibitor表达明显下调，MLC1f表达明显上调.尼美舒利通过上诉蛋白质经COX-2依赖或非依赖途径发挥抗肿瘤作用的机制尚不清楚，有待进一步明确.②尼美舒利干预后裸鼠移植瘤中TPM1、TPM2表达明显上调，进一步证实COX-2抑制剂尼美舒利通过上调TPM1、TPM2的表达抑制肺腺癌的增殖和转移.③尼美舒利干预后裸鼠移植瘤组织中Rho GTP酶表达明显下调，表明其明显降低肺腺癌细胞中Rho GTP酶的活性水平，通过抑制RhoA/Rho kinases（ROCK）通路，增加上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）和α-连环蛋白（α-caatenin）水平，稳固细胞连接形式及减少细胞运动.④尼美舒利干预后裸鼠移植瘤组织中hnRNPA2/B1表达明显下调.COX-2mRNA的3'-UTR区域能表达一种多聚体蛋白，这个多聚体蛋白中包含RNP，选择性COX-2抑制剂尼美舒利抑制COX-2mRNA的表达，从而抑制hnRNP A2/B1的产生，抑制肺癌细胞的分化、浸润剂转移.⑤在下调的蛋白质中发现一个未命名蛋白质，为我们将来的研究提供了方向.总之，通过这些蛋白质的鉴定对于确定尼美舒利抗肺癌作用的机制具有一定指导意义，也为进一步研究尼美舒利奠定了基础.

［1］眭维国，黄礼玲，陈洁晶，等.蛋白质组学技术在癌症相关研究中的应用［J］.医学综述，2008，14（23）：3596-3599.

［2］李文凯，李子博.蛋白质组学——门正在崛起的蛋白质分子生物学［J］.长沙医学院学报，2007，12（25）：31-43.

［3］Wilkins MR，Pasquali C，Appel RD，etal.From protein to Proteom ics：Large scale protein identification by two-dimensional electrophoresis and amide acide analysis［J］.Biotechnology（N Y），1996，14（1）：61-65.

［4］Bartosh TJ，Ylostalo JH，Bazhanov N，et al.Dynamic compaction of humanmesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent IL1 signaling to enhance secretion ofmodulators of inflammation and immunity（PGE2，TSG6 and STC1）［J］.Stem Cells，2013，31（11）：2443-2456.

［5］李 根，陈 虹.选择性COX-2抑制剂塞来昔布抗癌作用研究进展［J］.武警后勤学院学报：医学版，2012，21（3）：214-216，220.

［6］Chen M，Yu L，Gu C，etal.Celecoxib antagonizes the cytotoxic effect of cisplatin in human gastric cancer cellsby desreasing intracellualarcisplatin accumulation［J］.Cancer Lett，2013，329（2）：189-196.

［7］Pawlak G，McGarvey TW，Nguyen TB，et al.Alterations in tropomyosin isoform expression in human transitional cell carcinoma of the urinary bladder［J］.Int JCancer，2004，110（3）：368-373.

［8］Bharadwaj S，Prasad GL.Tropomyosin-1，a novel suppressor of cellular transformation is downregulated by promotermethylation in cancer cells［J］.Cancer Lett，2002，183（2）：205-213.

［9］Yi Z，Jingting C，Yu Z.Proteomics reveals protein profile changes in cyclooxygenase-2 inhibitor-treated endometrial cancer cells［J］.Int J Gynecol Cancer，2009，19（3）：326-333.

［10］Zhang SZ，Xie HQ，Xu Y，et al.Regulation of cell proliferation by fast Myosin light chain 1 in myoblasts derived from extraocularmuscle，diaphragm and gasteocnemius［J］.Exp Biol Med（Maywood），2008，233（11）：1374-1384.

［11］Fukata M，Kaibuchi K.Rho-family GTPases in cadherin-mediated cell-cell adhesion［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（12）：887-897.［12］Asnaghi L，VassWC，Quadri R，et al.E-cadherin negatively regulates neoplastic growth in non-small cell lung cancer：role of Rho GTPases［J］.Oncogene，2010，29（19）：2760-2771.

［13］Chang YW，Marlin JW，Chance TW，etal.RhoA mediates cyclooxygenase-2 signaling to disrupt the formation ofadherens junctions and increase cellmotility［J］.Cancer Res，2006，66（24）：11700-11708.

［14］Takaoka K，Kishimoto H，Segawa E，et al.Elevated cellmigration，invasion and tumorigenicity in human KB carcinoma cells transfected with COX-2 cDNA［J］.Int JOncol，2006，29（5）：1095-1101.

［15］Kamma H，Fujimoto M，Fujiwara M，et al.Interaction of hnRNP A2/B1 isoformswith telomeric ssDNA and the in vitro function［J］. Biochem Biophys Res Commun，2001，280（3）：625-630.

［16］Montuenga LM，Zhou J，Avis I，et al.Expression of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 change with critical stages ofmammalian lung development［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1998，19（4）：554-562.

［17］Sueoka E，Goto Y，Sueoka N，et al.Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein B1 as a new marker of early detection for human lung cancers［J］.Cancer Res，1999，59（7）：1404-1407.

［18］卢兆桐，付 强，耿 明，等.异质性细胞核核糖蛋白A2/B1在非小细胞肺癌的表达研究［J］.实用医药杂志，2003，20（3）：161-163.

Mechanism of protein expression profile in the anticancer effect of selective COX-2 inhibitors

ZHU Tian-Ji，ZHANGQing
Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China

AIM：To study themechanism of protein expression profiling in anticancer effect of selective COX-2 inhibitor nimesulide by researching nimesulide's effect on protein expression in lung cancer with the assistance of two-dimensional gel electrophoresis，mass spectrometry and bioinformatics techniques，and by separating and identifying relative proteins.M ETHODS：Nude mice models with lung adenocarcinoma A549 xenografted tumor were established and interrupted with nimesulide.Total protein of mice in the nimesulide group and control group were separated by two-dimentional gel electrophoresis.Differential protein spotswere analyzed by PDQUEST7.2，and mass spectrum was identified. RESULTS：By two-dimentional gel electrophoresis-image analysis-mass-spectrometric technique，14 differential protein spots were indentified.Among them，11 decreased in nimesulide group and 3 increased in the control group remarkably.CONCLUSION：The deferentially expressed proteins identified by mass spectrometer are of importance in guiding the research on anticancermechanism of nimesulide and thus can lay the foundation for further studies.

lung cancer；A549 xenografted tumor；proteomics；mass spectrometry

R734.2

A

2095-6894（2015）11-001-04

2015-10-14；接受日期：2015-10-30

内蒙古医科大学第一附属医院重大项目（NYFY ZD 2012001）

朱天吉.硕士，副主任医师.E-mail：zhutianji168@126.com

张 卿，E-mail：fczhangqing@126.com