高α-酸型马可波罗啤酒花挥发性成分的研究∗

刘玉梅，王利平，白珊珊，徐海宁

(1.新疆大学 化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214000)

啤酒花被誉为“啤酒的灵魂”[1]，对啤酒的风味起着至关重要的作用.按照啤酒花的α-酸含量及其用途不同，国际上通常将啤酒花分为优质香型花、香型花、苦型花和高酸型花等几大类[2].业界普遍认为，香型啤酒花是赋予啤酒特殊的酒花香气的关键因素[3]，因此，对香型啤酒花的风味成分及其在啤酒中的含量变化研究较多[4−6]，而苦型啤酒花的添加主要是提供了啤酒独特的苦味和防腐作用，对其风味成分的研究关注较少.由于在啤酒酿造过程中，香型啤酒花通常在麦汁煮沸结束前几分钟添加，而苦型啤酒花则常在麦汁煮沸的过程中添加，在啤酒中的利用率要明显高于香型啤酒花[7]，而我们近期的研究也表明，苦型啤酒花的品种和数量对最终啤酒的酒花风味也会产生明显的影响[8].中国尽管也是啤酒花的原产地之一，但啤酒花的品种（特别是在国际上具有竞争力的啤酒花品种）相对较少.马可波罗啤酒花是新疆引种培育的一个高α-酸的啤酒花新品种，因产量高，加工性能好，近年来种植面积逐渐扩大.本研究以马可波罗啤酒花为研究对象，采用HS-SPME-GC-MS分析方法，以质谱数据库检索和保留指数（Kovats retention indices RI）计算相结合的方法进行定性，用面积归一化来定量，对马可波罗颗粒啤酒花、啤酒花浸膏，分子蒸馏精油和水蒸气蒸馏的精油的主要成分的组成和含量信息进行了比较性研究，以期能为啤酒厂的生产提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

马可波罗啤酒花：由新疆三宝乐农业科技开发有限公司提供；C6-C26正构烷烃标准品：购于Sigmaaldrich公司.

1.2 仪器设备

Finnigan Trace MS气相色谱-质谱联用仪；手动SPME进样器，100µmPDMS萃取头，美国SUPELCO公司产品；MD-S80分子蒸馏装置，广州汉维机电有限公司；121-50-2型超临界萃取装置，江苏华安南通超临界CO2萃取有限公司；实验室水蒸气蒸馏装置

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

马可波罗颗粒啤酒花：马可波罗啤酒花颗粒经脱气充氮包装处理后，在-2◦C以下储藏，使用前取出粉碎.

马可波罗水蒸气蒸馏酒花油：将上述颗粒啤酒花粉碎后置于试验室自制的水蒸气蒸馏装置中进行蒸馏，得到马可波罗啤酒花的水蒸气蒸馏样品.

马可波罗啤酒花浸膏：采用超临界CO2萃取的方法，将前述颗粒啤酒花粉碎后放入超临界CO2萃取的萃取釜中，控制萃取温度45◦C，萃取压力25 MPa，分离温度65◦C，分离压力6 MPa，CO2流速20L/h，循环萃取2h，得到马可波罗啤酒花浸膏样品.

分子蒸馏啤酒花油：将上述步骤获得的马可波罗啤酒花浸膏样品于60◦C水浴中预先融化后，置于MDS80的分子蒸馏装置的贮料罐中，打开系统真空系统，控制体系真空度在2∼3Pa，蒸馏温度65◦C的条件下，以500 mL/h的物料流速进行蒸馏1h，得到分子蒸馏马可波罗啤酒花油样品.

1.3.2 分析条件

色谱柱：PEG20M毛细管色谱柱，30 m×0.25 mm×0.25µm；检索谱库：NIST2005、Wiley7.0；色谱条件：起始柱温35◦C，保留2 min，以8◦C/min速度升温至100◦C，然后再以6◦C/min的速度升温至230◦C，保留6 min，载气He，不分流进样，恒流0.8 mL/min，进样口温度250◦C，接口温度250◦C；质谱条件：离子源温度200◦C，电离方式EI+，电子能量70 eV，发射电流200µA，检测器电压350V，扫描质量范围33∼453 amu.

采用静态顶空固相微萃取法：取0.2 g上述各种啤酒花样品放入6 mL顶空瓶中，于50◦C的水浴中用已老化至无杂质峰的萃取头吸附40 min，然后进GC-MS分析.

1.3.3 定性定量分析

通过谱库检索、保留指数RI的计算值与文献值[9,10]进行比对，对成分进行定性，定量采用峰面积归一化来计算.保留指数计算如下：

其中TR(x)，TR(z)，TR(z+1)分别为被分析组分和碳原子数处于Z和Z+1之间的正构烷烃的流出峰的调整保留时间(min).

2 结果分析

啤酒花采收后由于水分含量高，不易储存，需将其烘干、压缩、打包后冷藏存放，在酿造啤酒时粉碎后直接加入麦汁煮沸锅中.由于压缩啤酒花体积较大，储存不便，而且储存过程中活性成分损失较快，酿酒过程的利用率也较低.因此，近20多年来，为了提高啤酒花的储藏品质，也为了减少存放空间，通常在不添加任何添加剂的条件下将干燥的啤酒花粉碎后压制成长15 mm、直径6 mm左右的短棒状，然后进行真空充氮包装，这就是所谓的“颗粒啤酒花”.啤酒花颗粒在成分上与啤酒花一致，完全保持了其特有的风味特征，在储存和使用上都比压缩啤酒花更为方便，但并未从根本上解决其利用率低的问题.目前，采用超临界CO2萃取技术获得的啤酒花浸膏，因能基本上保持啤酒花的主要特征风味已在国内外啤酒厂中大量使用.由于啤酒花浸膏不但可以节省储存空间，在长期的保存过程中活性成分也比较稳定，在一定程度上还可以缓解由于啤酒花产量过剩而给农民带来的损失.马可波罗啤酒花是近年来新培育的高酸型苦型花品种，为了考察加工过程对啤酒花挥发性成分的影响，也为了给啤酒生产厂家提供基础数据参考，本实验采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用的方法（HS-SPME-GC-MS），在分析了啤酒花颗粒的挥发性成分基础上，比较了在加工过程中，不同的加工工艺对马可波罗啤酒花挥发性成分所产生的影响.图1为马可波罗颗粒啤酒花样品的总离子流图.

图1 马可波罗啤酒花代表性样品的总离子流图（颗粒啤酒花）

为了保证实验数据的一致性，文中采用同一批次生产的啤酒花来完成实验，采用顶空固相微萃取的方法不仅分析速度和检测灵敏度高[11,12]，而且也保证了对样品中挥发性成分的前处理过程的一致性.由于啤酒花挥发性成分以萜烯和倍半萜烯类物质为主，存在很多结构相近的同分异构体，这类化合物的质谱碎片相似，仅以质谱数据库定性尚不够准确.为了使得定性结果更为可靠，本实验采用C6-C26的正构烷烃标准品做对照，对分离的色谱峰保留指数进行计算，并通过与同类型色谱柱所查阅的文献值进行比较，最终确定样品中的各组分组成信息.文献中记载的保留指数与本实验中所采用的色谱柱及升温程序并非完全一致，故文中检索到的部分样品的保留指数与文献值并不完全一致，仅可作为定性的参考.

表1为HP-SPME-GC-MS分析马可波罗啤酒花的结果，其中二氧化碳浸膏、分子蒸馏精油和水蒸气蒸馏精油仅列出颗粒酒花中存在的共有组分.

表1 HP-SPME-GC-MS分析马可波罗啤酒花的挥发性成分及其提取物中共有组分

表1 续HP-SPME-GC-MS分析马可波罗啤酒花的挥发性成分及其提取物中共有组分

表1 续HP-SPME-GC-MS分析马可波罗啤酒花的挥发性成分及其提取物中共有组分

由表1的数据可知，马可波罗颗粒啤酒花共鉴定出96个组分，占总峰面积的99.25%，其主要挥发性成分是以2-β-蒎烯、β-香叶烯、d-柠檬烯、β-罗勒烯、1,3,8-对薄荷三烯、古巴烯、β-石竹烯、α-葎草烯、δ-杜松烯、依兰油烯、γ-杜松烯、α-蛇床烯、β-蛇床烯、3,7(11)-桉叶二烯、1S,cis-菖蒲萜烯等为代表的萜烯类化合物和以丙酮、里哪醇、α-桉叶油醇、4-癸烯酸甲酯、乙酸香叶酯等为代表的含氧化合物，主要化合物组成为碳氢类化合物、脂类、醇类、以及少量的醛、酮、酸类和萜烯类氧化物.与颗粒酒花相比，马可波罗酒花浸膏中的共有组分峰面积为96.94%，分子蒸馏的酒花精油中共有组分的总峰面积为92.03%，而水蒸气蒸馏的酒花精油中的共有峰的峰面积仅为81.81%.说明在加工过程中，啤酒花的风味发生了一定的变化，特别是水蒸气蒸馏的啤酒花精油，由于较长时间的高温作用，其中的成分发生了比较明显的转变[14].表1中的数据还可以看出，不仅总的峰面积发生的变化，共有组分的组成成分和含量也发生了较大的变化.四种啤酒花样品中的共有挥发性成分的组成及含量见表2.

表2 四种啤酒花样品中的共有挥发性组分的比较

表2的数据表明，与颗粒啤酒花相比，CO2浸膏的挥发性成分与其最为接近.结合表1的数据可以看出，尽管两者在碳氢化合物的总含量、醛酮、醇类、酯类化合物等的组成上都非常相似，但碳氢化合物的组成与醛酮、醇类、酯类化合物的含量上还是发生了一定的变化.以酒花中主要的萜烯类物质的含量变化来看，在CO2浸膏的提取过程中，分子量相对较小、低沸点的香叶烯在加工过程中大量损失，相对含量从31.33%下降到了14.02%，同样，进一步采用分子蒸馏提取的酒花精油所获得的数据也证实了这一结论，其在酒花油中的相对含量仅为2.0%.而分子量相对较大、沸点较高的葎草烯和石竹烯，在提取CO2浸膏的过程中由于损失较小，被进一步富集，相对含量分别从12.31%和9.5%提高到了20.61%和16.13%，但葎草烯与石竹烯的比值基本保持不变，该比值也是评价啤酒花香气的一个重要指标.进一步的分子蒸馏提取精油过程中，葎草烯与石竹烯相对含量也基本保持稳定，分别为18.21%和16.52%.对比颗粒酒花与CO2浸膏的化合物组成显示，在加工过程中，颗粒酒花中存在的很多沸点相对较低的组分，在加工过程中损失较为明显，如α-侧柏烯、2-β-蒎烯、α-香叶烯、γ-萜品烯、别罗勒烯、新别罗勒烯、波斯菊萜等成分在CO2浸膏中已经无法检测到存在，相应的分子蒸馏精油中也没有检测到这些化合物，而在颗粒酒花中相对含量较低或检测不到的一些含氧化合物，如醇类、酯类和萜烯氧化物等的种类和含量都明显提高，这一方面是由于低沸点组分的损失使得这些化合物在提取物中得以富集，另一方面也是由于加工过程中部分萜烯类化合物向萜烯醇转化而引起的，如橙花醇，香茅醇等在颗粒酒花中并不存在，而在加工产品中均检测到了该组分，CO2浸膏中相对含量为0.3%，分子蒸馏精油中的相对含量为0.74%，这些物质的产生对协调啤酒产品中的酒花香气具有非常重要的作用.

水蒸气蒸馏获得的啤酒花油无论是组成成分还是相对含量上与前三个样品均存在较大的差异.由于水蒸气蒸馏酒花油的过程中需要在较高的温度下处理一定的时间，这一个过程中，低沸点的挥发性成分会大量损失，碳氢类化合物的含量已下降到了67.86%，而醇、酯和萜烯类氧化物的比例大幅提高，分别达到了7.5%、11.03%和11.34%，这些成分很多在颗粒酒花中检测不到或仅有微量存在.比较水蒸气蒸馏的酒花油与颗粒酒花的挥发性成分的数据表明，水蒸气蒸馏酒花油中β-香叶烯含量仅为颗粒酒花中的43%，其它一些在颗粒酒花中含量较高的罗勒烯、蒎烯、萜品烯、1，3，8-对薄荷三烯、别罗勒烯、柠檬烯等检测不到或含量明显下降，而香叶醇（0.37%）、橙花醇(56%)、萜品烯醇(0.35%)、罗勒醇(0.47%)、香茅醇(0.17%)、芳樟醇(0.66%)、紫苏醇（0.27%）、金合欢醇杜松醇（0.90%）、桉叶油醇（0.69%）等物质从无到有或者含量明显提高，都说明了在水蒸汽的作用下酒花中的一些萜烯类物质发生了结构转化或氧化为其醇类[15].

3 结论

早期研究中人们普遍认为，萜烯类物质对啤酒的酒花风味发挥着关键性作用，但近年来的研究发现，亲水性较强的萜烯醇类对啤酒风味的贡献更为明显[16].通过比较马可波罗啤酒花的颗粒酒花及其深加工产品马可波罗CO2浸膏、分子蒸馏的酒花精油、水蒸气蒸馏的酒花精油的挥发性成分的结果表明，啤酒花挥发性成分以萜烯类化合物为主，其中CO2浸膏因加工工艺条件温和，与颗粒酒花的共有组分数量最多（达78个），组成也最为接近，除加工过程中低分子量的成分香叶烯等部分损失外，样品中仅有相对含量约2.5%的其它化合物出现，比较完整的保留了酒花的特征风味.而通过分子蒸馏获得的啤酒花精油，由于加工过程温度也相对较为温和，且物料与热源接触时间短，除由于分子蒸馏的工艺特点导致的低沸点物质损失和短暂高温引起的含氧化合物如醇、醛、酮、酯和氧化物的数量明显多于CO2浸膏外，保留下来的组分基本与CO2浸膏中的共有组分含量比例极为接近，不仅萜烯类化合物的总量接近76%，与颗粒酒花相比共有组分的相对比例也达到了92%.而水蒸汽蒸馏酒花油由于温度高，提取时间长，已不能完全反映出啤酒花本身的风味特征，不仅低沸点的头香类组分损失较多，共有组分的数量也较少（仅有56个），且含量变化也较大，但水蒸气蒸馏提取啤酒花油的过程比较接近啤酒酿造的麦汁煮沸过程，更能反映出在啤酒酿造过程中啤酒花风味成分的转化或氧化转变的途径.