hsa-miR-144在肺结核中的表达及临床意义

谭　燕

hsa-miR-144在肺结核中的表达及临床意义

谭燕

目的 观察hsa-miR-144在肺结核中的表达及临床意义。方法 收集50例肺结核患者抗结核治疗前及治疗后的血液样本，其中包括30例初治型及20例难治型肺结核，同时收集15例健康人员的血液标本，分别采用实时荧光定量 PCR（Q-PCR）检测hsa-miR-144的表达。结果 hsa-miR-144在肺结核患者中的表达明显高于健康人员，差异有统计学意义（P＜0.01）。同时，肺结核患者经抗结核治疗后hsa-miR-144表达显著下降（P＜0.05），其中初治型肺结核患者中hsa-miR-144下降较难治型肺结核更为明显（P＜0.05）。结论 hsa-miR-144表达与肺结核的发生及发展相关，其表达的检测有助于肺结核的诊断及治疗。

hsa-miR-144 肺结核 实时荧光定量 PCR

结核病（tuberculosis）是一种较为常见的传染性疾病，据报道称近年来我国结核病发病率正逐渐上升，年发病人数已达100万，因结核发病导致死亡的年均死亡人数可达5.4万，病死率约为4.1/10万［1］。然而，关于结核病的发病机制尚未完全清楚，目前研究认为结核病的发生主要与机体自身免疫调节功能低下或紊乱有关，为此，研究与结核病相关的分子标志物将具有重要的意义，结核病早期相关分子标志物的筛选将有助于结核病的诊断及治疗。近年来，研究表明微小RNA（micoRNA， miRNA）的表达与多种疾病相关［2］；本资料旨在观察hsa-miR-144在肺结核中的表达及其临床意义。

1　临床资料

1.1一般资料 收集本院2012年3月至2013年12月的50例肺结核患者血液标本，其中包括30例初治型及20例难治型肺结核。初治型肺结核包括男19例，女11例；年龄12～28岁，平均年龄21.5岁。难治型肺结核包括男12例，女8例；年龄28～48岁，平均年龄33.5岁。所有肺结核患者均经痰抗酸杆菌涂片确诊为阳性。判定标准为采用结核菌特异性酶联免疫斑点试验阳性，初治型肺结核而胸片未见明显异常，而难治型肺结核中部分患者可见明显结核病灶及肺纤维化。所有肺结核患者均经痰抗酸杆菌涂片及分离培养确诊为阳性，并接受抗结核治疗＞3个月同时，收集15例健康患者的血液标本。所有观察对象均排除HIV、乙肝、丙肝等传染病及其他自身免疫性疾病等。

1.2标本的收集、处理及RNA的提取 收集患者早晨空腹2ml外周静脉血，加入肝素锂抗凝，再进行分装；取500μl全血加入Trizol，室温静置10min，充分裂解细胞；再加入100μl氯仿，剧烈振荡20s，室温放置10min，以12000r/min，于4℃离心机内离心10 min。取上层水相加入等体积异丙醇充分混匀，室温放置5min，以12000r/min，于4℃离心机内离心10min。再以75%乙醇洗涤沉淀物2 次，室温晾干，加入适量DEPC水充分溶解，取2μl检测RNA浓度，其余置于-80℃保存。

1.3实时荧光定量 PCR（Q-PCR） 采用TAKARA生物公司的反转录-荧光定量PCR检测试剂盒进行，其中miRNA反转录反应体系为10 μl，包括反转录缓冲混合物5 μl，总RNA 0.5μl，反转录酶1 μl，0.1% BSA 1μl，RNase Free水2.5 μl，。反应条件为37℃60min，85℃5min。荧光定量PCR反应体系为20 μl，其中包括cDNA 模板1μl，SYBR Greenl0μl，上、下游引物各1 μl，RNase Free水7μl。反应条件为预变性95℃12 s，变性和延伸95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环，引物退火温度60℃。其中hsa-miR-144引物序列为hsa-miR-144：5'-GCGCTACAGTATAGATGATGTAC-3'，以 U6 为内参照，引物均由深圳华大基因公司设计合成。以Folds=2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量，计算公式为：ΔΔCt=［ΔCt（目的基因）-Ct（U6）］观察组-［ΔCt（目的基因）-Ct（（U6）］对照组。

1.4统计学方法 采用SPSS 13.0 统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0. 05为差异有统计学意义。

2　结果

采用QPCR检测50例肺结核患者治疗前与15例健康人员中hsa-miR-144的表达，结果表明hsa-miR-144在肺结核患者中的平均表达量为（12.35±1.25），明显高于健康患者中的表达量（8.35±0.85），差异具有统计学意义（P＜0.01），见表1。同时，分析了结核患者抗结核治疗前及治疗后hsamiR-144的表达，结果显示治疗前、后hsa-miR-144的表达分别为（12.35±1.25）、（9.75±0.55），两者差异亦具有统计学意义（P＜0.05）。此外，结合结核患者的类型，比较初治型患者及难治型患者治疗前后hsamiR-144的表达，结果见表2，结果提示经治疗后hsa-miR-144表达均显著下降（P＜0.05），但初治型肺结核患者中hsa-miR-144下降较难治型肺结核更为明显。

表1　hsa-miR-144在结核及健康患者中的表达（±s）

表1　hsa-miR-144在结核及健康患者中的表达（±s）

分组nhsa-miR-144表达量P值结核组5012.35±1.25＜0.01健康组158.35±0.85

表2　治疗前后hsa-miR-144在结核患者中的表达（±s）

表2　治疗前后hsa-miR-144在结核患者中的表达（±s）

分组n治疗前治疗后P值初治型3013.31±2.859.61±2.31＜0.05难治型2011.32±2.359.82±2.34＜0.05

3　讨论

miRNA为内源性非编码小分子RNA，长度一般为19～22nt，其主要通过参与转录后蛋白水平的调控，降解靶基因的mRNA或抑制其蛋白翻译，从而调控靶基因的功能；其表达广泛参与细胞分化、侵袭、增殖、凋亡、血管生成等，与多种疾病的发生及发展密切相关［3］。近年来研究发现miRNA与机体的免疫功能相关，参与机体的固有免疫及适应性免疫。其中，研究证实miR-144-3p可通过抑制T细胞的增殖调节机体的抗结核免疫反应，其在肺结核患者中的表达量也相应高于肺正常患者［4］。此外，刘守江等［5］研究表明miRNA144-3p在结核潜伏感染者全血中的表达明显高于活动性肺结核患者。因此，miRNA144表达与肺结核有关。

本资料结果显示，hsa-miR-144在肺结核患者中的表达明显高于健康人员，肺结核患者经治疗后hsamiR-144表达水平明显下降，其中初治型肺结核与难治型肺结核患者中hsa-miR-144表达水平均明显下降，提示hsa-miR-144与肺结核的疗效相关；同时，结果亦表明初治型肺结核患者经治疗后，hsa-miR-144水平的下降较难治型肺结核更明显，提示初治型肺结核中hsa-miR-144的表达对治疗中更为敏感。因此，hsa-miR-144可作为肺结核诊断及疗效评估的有效指标。

总之， hsa-miR-144表达与肺结核的发生及发展相关，其表达的检测有助于肺结核的诊断及治疗。但是，由于本资料纳入的样本量并不大，抽样误差的存在难以避免，大样本量的重复性研究仍具有重要的意义。

1 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2012，8（34）：485～508.

2 史玉仓，梁杰. miRNA 与肿瘤及其对瘢痕疙瘩作用研究进展. 齐齐哈尔医学院学报，2014，35（1）：107～109.

3 傅军，吴雪英. 微小RNA与乳腺癌侵袭转移关系的研究进展. 福建医药杂志，2014，36（1）：139～140.

4 Liu Y，Wang X，Jiang J，et al.Modulation of T cell cytokine production by miR-144 with elevated expression in patients with pulmonary tuberculosis. Mol Immunol，2011，48（ 9～10） ： 1084～1090.

5 刘守江，张帆，魏巍，等.结核潜伏感染者全血miR-144-3p、miR-146a-5p 的表达. 临床肺科杂志，2013，18（7）：1270～1271.

325400 浙江省平阳县人民医院感染科