内蒙古传统发酵乳中优质乳杆菌的筛选与鉴定

李周勇，陈云，史玉东，母智深

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古呼和浩特011500）

内蒙古传统发酵乳中优质乳杆菌的筛选与鉴定

李周勇，陈云，史玉东，母智深*

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古呼和浩特011500）

从内蒙古鄂尔多斯市乌审旗多户牧民家庭自制的传统发酵乳制品中，共分离得到36株乳杆菌。经发酵特性试验筛选，共得到2株同时具有优良产酸和产黏特性的乳杆菌，它们分别是WSQ-18和WSQ-34。经16s rDNA鉴定与API50辅助鉴定，确定WSQ-18为德氏乳酸杆菌乳酸亚种2、WSQ-34为植物乳杆菌1。将两株乳杆菌与嗜热链球菌进行复配发酵试验，并与市售酸奶对照，最终确定WSQ-18为试验菌株，具有作为酸奶发酵剂的可能性。

乳酸杆菌；发酵特性；种属鉴定；复配

乳酸菌广泛存在于自然环境中［1］，可以从生鲜乳及传统发酵乳制品中分离得到，经过进一步纯化、培养和传代，以及和其它具有不同生理特征和发酵代谢特征的菌种混合，从而得到具有不同特征的新型发酵乳制品，然后可进一步应用于工业生产。我国牧区大部分传统乳制品的制作方法都有其独特的户籍性和地域性［2］，因此所产出的发酵乳制品便也同时具备了浓重的地域性特色和独特风味。

内蒙古鄂尔多斯市乌审旗地区的原住居民千百年来始终沿袭当地传统而古老的制作方法发酵乳制品［3］。制作工艺简单、口感纯正、组织细腻、产品风味独具特色，而且在保证其状态和口感的条件下，还能在自然温度下保存较长时间。这表明这些传统发酵乳制品中极有可能含有凝乳状态稳定、传代性能好以及产品风味独特的优良乳酸菌株［4］。在此基础上，试验采集了内蒙古鄂尔多斯市乌审旗本地牧民家庭的3份传统发酵乳制品，希望从中筛选出具有优良产酸、产黏性能的乳杆菌，应用于酸奶的工业化生产。

1材料与方法

1.1试验材料

1）试验菌株：36株乳杆菌（采自内蒙古鄂尔多斯市乌审旗多个牧民家庭自制的传统发酵乳，超低温冰箱-80℃保存）；现有菌株，嗜热链球菌MN12（蒙牛乳业微生物工作室保存）。

2）培养基：MRS液体培养基、MRS琼脂培养基、API50CHL培养基（北京陆桥技术有限责任公司）；脱脂乳培养基［12%（g/mL）的脱脂乳、115℃灭菌15 min］。

3）试剂：市售原味酸奶（维多利超市）；脱脂乳粉、甘油、酞批示剂、结晶紫染液、番红染液、氢氧化钠等（北京陆桥技术有限责任公司）。

1.2设备

G560E漩涡混合器：美国SCIENTIFIC Instruments公司；CP21GⅡ高速冷冻离心机：日本日立公司；Premium U410超低温冰箱：美国NBS公司；HV-110高压灭菌锅：日本Hirayama公司；SVE-6A1超净台：新加坡ES CO公司；LVDV-Ⅱ+P旋转式粘度计：美国Brookfield公司；Sartorius pH酸度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3方法

1.3.1乳杆菌的纯化

超低温冰箱-80℃保存的菌株采用脱脂乳培养基传代活化，之后采用MRS琼脂培养基划线接种，于37℃条件下恒温培养24 h。挑取单菌落于MRS斜面培养基上纯培养。对培养物进行革兰氏染色并镜检［5］，直到确认为纯菌种。采用MRS半固体培养基穿刺培养，菌种于4℃冰箱内保存备用。

1.3.2优良产酸、产粘菌株的筛选

1）酸度的测定

样品后熟24h后，采用国标酸碱滴定法测定酸度［6］。

2）黏度的测定

采用LVDV-Ⅱ+P旋转式粘度计进行一点式测定［7］，根据样品的黏度范围最终选择63号转子，转速50 r/min，在测定温度4℃条件下，测试10 s记数，重复测量3次取算术平均值。黏度单位为mPa·s。

3）发酵特性试验

凝乳时间：将活化好的菌株以3%的接菌量接种到质量分数为12%的脱脂乳中，于43℃条件下恒温发酵，每隔0.5 h测定一次样品的pH。待样品pH降低到4.6或以下，记录菌株发酵脱脂乳至凝乳的时间。

产酸速度：分别测定发酵初始和发酵15 h后样品的pH和酸度，计算平均每小时样品pH和滴定酸度的变化量即为菌株的产酸速度［8］。

后酸化度：脱脂乳接菌后在培养过程中，分别在第15小时和60小时取出，测定样品的pH和滴定酸度。在第15小时至60小时的培养过程中，每小时pH和酸度的平均变化量，即表示为后酸化度［9］。

黏度测定：根据试验结果，保留初始凝乳时间≤6 h的菌株，并选取其中产酸速度快、后酸化程度弱的菌株。待样品凝乳后取出，破乳并于4℃冰箱内后熟24 h，取出测定黏度。

1.3.3菌株种属鉴定

1）菌株16 s rDNA鉴定［10］

PCR扩增：PCR体系50μL，反应条件：95℃/5 min， 95℃/40 s，50℃/40 s，72℃/1 min，进行31个循环；72℃/ 5 min，收集PCR产物，由天津生物芯片有限公司测序。

2）菌株API50辅助鉴定［11］

采用16s rDNA进行种属鉴定，其结果有时可能会与两个或多个种属同源性达到95%以上的相同数值，因而无法将菌株鉴定至种。API50CHL适用于乳酸杆菌（Lactpbacillus）和相关菌的鉴定，它是由49种可发酵碳水化合物的API 50 CH试验条组成的简易培养基。结合16s rDNA鉴定结果，采用API50CHL鉴定的方法，可将乳杆菌进一步鉴定至种水平。

1.3.4混合发酵试验［12］

将发酵特性试验筛选出的优良产酸、产黏乳杆菌与实验室保留的嗜热链球菌按1∶1的接菌比例，2%的总接菌量进行复配发酵酸奶，以市售原味酸奶为对照。在后熟24 h后测定样品各项指标的变化，分析评价筛选所得菌株作为酸奶发酵剂的可行性。

1）酸奶的制作流程［13］

牛奶（杂菌＜500 000 CFU/mL，酸度＜18°T）→配入7%的白砂糖，搅拌乳化1 h→均质（压力为20 MPa）→加热杀菌（95℃、5 min）→冷却至43℃→加入发酵剂（接种量3%）→42℃下恒温发酵→搅拌冷却→4℃后熟24 h

2）乳清析出率［14］

将100 g酸奶从4℃贮藏条件下取出，立即倒入大漏斗（带有120目不锈钢丝网），从下方收集析出的乳清，2 h后称量乳清重量。

3）黏稠度

采用LVDV-Ⅱ+P型旋转黏度计进行一点测定，通过试验最终选择28号转子，转速为50 r/min，在常温下，测试30 s记数，重复测量3组取平均值。黏度单位为mPa·s。

4）感官评定

由10名蒙牛乳业乳品研发团队的专业人员组成品评小组，对样品的总体色泽、滋气味、组织状态等进行评分。总分＞90分的，定为优质酸奶；总分在80分～90分之间的，定为良质酸奶；总分＜80分的，定为次质酸奶。感官评定标准见表1。

2结果与分析

2.1乳杆菌的分离纯化结果

从内蒙古鄂尔多斯市乌审旗多户牧民家庭自制的传统发酵乳制品中，通过前期采用革兰氏染色与过氧化氢酶试验相结合的方法［16］，初步筛选出62株乳酸菌，经进一步镜检纯化试验，确认共得到乳杆菌36株，并依次命名为“WSQ-”系列。

表1　感官评定标准［15］Table 1Standard of organoleptic investigatio

2.2优良产酸、产黏菌株的筛选结果

2.2.1菌株产酸试验结果

2.2.1.1菌株凝乳时间测定结果

菌株凝乳时间测定结果见表2。

表2　菌株凝乳时间Table 2The time of strain curding

由表2可以看出，活化好的菌株在43℃条件下恒温发酵，6 h内能发酵脱脂乳至凝乳的菌株共有9株，它们分别是：WSQ-05、WSQ-09、WSQ-13、WSQ-18、WSQ-19、WSQ-24、WSQ-28、WSQ-30、WSQ-34，其中WSQ-09的凝乳时间最短，为3.5 h。因此，保留这9个菌株继续进行其它产酸试验。

2.2.1.2菌株产酸速度及后酸化程度测定结果

菌株产酸速度及后酸化程度测定结果见表3。

由表3可以看出，WSQ-09、WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34四株菌的产酸速度相对较快，与其它菌株差异显著。其中，WSQ-09菌株的后酸化程度严重，表明在15 h～60 h的培养过程中，产品的pH和酸度的变化过快。因此，选择后酸化弱的3株菌WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34继续进行产黏试验。

表3　菌株产酸速度及后酸化程度测定结果Table 3Measurement results of speed of strains produce acid and degree of after acidification

2.2.2菌株产黏试验结果

经4℃冰箱内后熟24 h，样品黏度如表4所示。

表4　菌株产黏试验结果Table 4Test results of strains produce viscosity

由表4可以看出，经4℃条件下后熟24 h后，WSQ-18和WSQ-34发酵样品的黏度值较大，分别为1 214.5 mPa·s和1 243.4 mPa·s，与WSQ-30样品的黏度值差异显著。

根据试验结果，初步筛选出两株具有优良产酸和产黏特性的乳杆菌，它们分别是WSQ-18和WSQ-34。试验最终选择WSQ-18及WSQ-34作为试验菌株，进行下一步种属鉴定及混合发酵试验。

2.3菌株种属鉴定试验结果

2.3.1菌株16s rDNA鉴定结果

经16s rDNA鉴定，结果表明，菌株WSQ-18与德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）的16s rDNA基因序列有着高达99.9%的同源性，可初步确定WSQ-18为德氏乳杆菌。WSQ-34与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）的16s rDNA基因序列有着相同的100%的同源性，暂时无法确定其种属。

2.3.2菌株API50辅助鉴定结果

菌株WSQ-18和WSQ-34经API 50 CH试验条的49种可发酵碳水化合物反应所得的生化图谱如下图1所示。

图1　菌株WSQ-18及WSQ-34的API50鉴定图谱Fig.1API50 identification map of WSQ-18 and WSQ-34

根据WSQ-18、WSQ-34的API50生化图谱图，与API50生化图谱标准对照表比对［17］，最终确定WSQ-18为德氏乳酸杆菌乳酸亚种2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2），WSQ-34为植物乳杆菌1（Lactobacillus plantarum 1）。

2.3.3菌株混合发酵试验结果

菌株混合发酵试验结果见表5。

表5　混合发酵试验结果Table 5Test results of mixed fermentation

由表5可以看出，经后熟24 h后，两个试验组样品的乳清析出率略高于对照组，但无显著差异。WSQ-18+MN12组样品的黏度与对市售酸奶无明显差异，WSQ-34+MN12组样品的黏度低于市售酸奶且差异显著。经专业人员感官品评，WSQ-18+MN12组与对照组品质接近，均为优质酸奶，WSQ-34+MN12组与对照组相比，品质有所下降，为良质酸奶。因此，根据以上试验结果，考虑到今后可能用于生产实际，试验最终选择WSQ-18（德氏乳酸杆菌乳酸亚种2）为试验确定菌株。

3结论

试验从内蒙古鄂尔多斯市乌审旗地区的传统发酵乳制品中共分离得到36株乳杆菌。经发酵特性试验筛选，共得到2株具有优良产酸和产黏特性的乳杆菌，它们分别是WSQ-18和WSQ-34。经16s rDNA与API50鉴定，确定WSQ-18为德氏乳酸杆菌乳酸亚种2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2）、WSQ-34为植物乳杆菌1（Lactobacillus plantarum 1）。经菌株混合发酵试验，最终选择WSQ-18（德氏乳酸杆菌乳酸亚种2）作为目标菌株。

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Screening and Identification for Lactobacillus from Traditional Fermented Dairy in Inner Mongolia

LI Zhou-yong，CHEN Yun，SHI Yu-dong，MU Zhi-shen*
（InnerMongoliaMengNiuDairyIndustry（Group）Co.，Ltd.，R&DCenter，Hohhot011500，InnerMongolia，China）

Test isolated 36 Lactobacillus strains in total from traditional fermented dairy which made by several herding families in Wushen league of Inner Mongolia.By screening of fermentation characteristic test，2 Lactobacillus with excellent acid and viscosity-producing characteristics were got，they were WSQ-18 and WSQ-34.By 16 s rDNA appraisal and API50 auxiliary appraisal，determine the WSQ-18 for Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2，WSQ-34 for Lactobacillus plantarum 1.The mixed fermentation experiment was carried out with two strains of Lactobacillus and streptococcus thermophilus，and compared with commercially available yogurt，determine the WSQ-18 for target strains eventually，as the possibility of yoghurt starter cultures.

Lactobacillus；fermentation characteristics；species identification；compound

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.037

2014-04-15

李周勇（1987—），男（汉），助理工程师，硕士研究生，研究方向：乳制品研究与开发。

母智深，副教授，主要从事乳品营养与工程方面的研究。