多重因素对雨生红球藻虾青素积累的影响

马欣欣，石蕾，杨巧利，耿金峰，冯倩，滕杰，赵鄢鹏，王雁，刘敏胜

（新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊065001）

多重因素对雨生红球藻虾青素积累的影响

马欣欣，石蕾，杨巧利，耿金峰，冯倩，滕杰，赵鄢鹏，王雁，刘敏胜*

（新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊065001）

虾青素独特的分子结构使其成为自然界最强的抗氧化剂，工业上成功利用雨生红球藻生产天然虾青素的生产模式均采取先藻细胞增殖、再虾青素积累的两步法，近年来用于积累虾青素的胁迫诱导方法仍然集中在高光照强度、高温、缺氮等传统典型胁迫条件，但开始倾向于这些方法的复合作用，同时也进行了异养培养、添加外源试剂、补充其他营养元素等多种尝试。

雨生红球藻；虾青素；积累；胁迫

虾青素（Astaxanthin）被认为是自然界最强的抗氧化剂，其化学名称为3，3'-二羟基-β，β'-胡萝卜素-4，4'-二酮，属于酮式类胡萝卜素，独特的分子结构不仅赋予它非常高的抗氧化活性，还具有抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及防治心血管疾病等功能。虾青素的应用十分广泛，包括水产养殖的饵料添加剂、人的食品添加剂，同时在药品、化妆品和高级营养保健品等领域也有非常广阔的市场。

虾青素在分子中两端环结构的C-3和C-3'有两个手性中心，每个手性中心可以有R或S形式的两种构象，这样可以形成3种立体异构体：2个羟基位于平面下方构成S构象（3S，3'S-虾青素）；2个羟基位于平面上方构成R构象（3R，3'R-虾青素）；1个羟基位于平面上方，1个位于平面下方的构成S，R构象（3S，3'R-虾青素和3R，3'S-虾青素），也称为左旋、右旋、消旋构型［1］。除此以外，虾青素还可根据几何异构、酯化与否和酯化程度等分为多种分子类型［2］，所有这些结构形式在自然界都存在，见表1。

表1　不同来源虾青素的结构Table 1The structure of astaxanthin from different sources

无论出于安全性考虑，还是由于顺式结构在动物体内无法转化，化学合成虾青素都越来越受到严格的限制；而甲壳纲生物、鲑鱼类和酵母来源的虾青素，则含量太低、养殖成本过高；只有雨生红球藻中的虾青素积累速率和生物总量最高，其100%的左旋（3S，3'S）结构，具有最强的生物学活性，另外雨生红球藻所含虾青素的脂类配比与动物体内的虾青素配比极为相似，最容易被吸收。因此，利用雨生红球藻高产虾青素是目前的研究热点。

目前工业上成功利用雨生红球藻生产虾青素的生产模式，一般均采取两步法培养［3］，首先是细胞增长阶段，需要在适宜条件下养殖雨生红球藻获得高浓度的绿色细胞，此阶段藻细胞一般培养在室内洁净的密闭光生物反应器中；其次是胁迫诱导阶段，需要转为多种胁迫条件，促使绿色细胞变为红色的不动孢子，实现虾青素的积累，此阶段往往将藻细胞转移至室外的开放反应器或跑道池中培养。用于胁迫条件积累虾青素的方法包括使用高光强、高盐度、氮饥饿和添加外源植物激素等，本文将着重对近年来研究增强雨生红球藻积累虾青素方法的最新进展进行综述。

1环境因素

1.1光照强度

光保护学说是雨生红球藻虾青素积累机制的最有影响的理论假设，由于虾青素的主要存在形式虾青素酯无论在疏水环境还是亲水环境下，都具有很强的抗氧化活性，所以Kobayashi M等推测虾青素能够清除光合过程中产生的大量活性氧，从而保护光合器官和光合色素免受氧自由基的破坏［4］。另一光保护理论认为，随着虾青素的积累，雨生红球藻细胞中聚集的色素颗粒逐渐增多，并且相互融合使体积增大，色素沉积的部位也从最初的核周围向四周扩展，直到占据细胞的大部分区域。虾青素的这种扩散作用能够增强对杯状载色体的遮光、防止光抑制发生，使红球藻细胞具有更强的耐高光强能力［5］。因此，高光照胁迫处理成为刺激雨生红球藻积累虾青素的主要研究方法。EsraImamoglu等在光照强度为546mmol/（m2·s）获得了30.07mg/g的虾青素浓度［6］；陈书秀等实验发现当光照强度为300 μmol/（m2·s）时单个细胞中的虾青素含量最高，但光照强度为50μmol/（m2·s）时单位体积内的虾青素含量最高［7］；Chang Duk Kang等使用400 μmol/（m2·s）的光照强度，虾青素产量可达到190 mg/L，产率为14 mg/（L·d）［8］；才金玲等研究认为240 μmol/（m2·s）的光强下，单个细胞内的虾青素产量最大［9］；顾洪玲等利用两种颜色的人工光源LED照射，在总光强为7000lx，蓝光与白光的强度比例为3∶1时，雨生红球藻中虾青素的积累量能达到39.79 mg/L［10］。

1.2温度

早期研究认为，雨生红球藻的适宜生长温度为25℃～28℃，提高温度将有利于藻细胞中虾青素的积累［11］，研究人员推测，高温会促进活性氧的产生，而活性氧有利于虾青素的积累［12］；另一种可能的原因是较高的培养温度抑制了雨生红球藻的正常分裂生长，从而提高了虾青素的相对含量提高。苗凤萍等研究温度对雨生红球藻产虾青素的影响时发现，25℃时虾青素产量最高，能达到13.53 mg/L，而22℃时虾青素含量最高，为1.52%［13］。梁英等实验表明20℃时单位体积的雨生红球藻中虾青素含量最高，而5℃和30℃时单个细胞中的虾青素含量最高［14］。Minxi Wan等在白天与晚上分别设置不同的养殖温度，指出白天28℃、晚间低于28℃的培养条件有利于促进雨生红球藻的生物质积累和虾青素含量提高［15］。

1.3其他环境因素

尽管高光照、高温是虾青素积累的重要胁迫条件，但研究人员往往采取多种条件复合影响的办法。蒋霞敏等从温度、光照与盐度3个因素进行正交试验，发现虾青素累积量最高时的温度为25℃～30℃，光照为8 000 lx，盐度为4%～8%，而后进一步进行盐度、光照的两因素胁迫正交试验，在光照为8 000 lx、盐度为8%时获得最高的虾青素含量［16］。张睿钦等研究的则是温度、光照和pH，得到温度为29.92℃、光照为7 203.95lx、pH为10的优化条件，转化10.6 d后，虾青素含量可达到（33.796±1.556）mg/L［17］。

2营养盐因素

2.1氮

利用对培养基的缺氮处理、胁迫诱导虾青素积累是最常用的方法之一，但是氮缺乏诱导虾青素累积的具体机理尚不明确，Feng DN等研究发现，在缺氮的情况下乙酰辅酶A羧化酶的活性及表达均高于氮充足条件下的水平，因此推测缺氮会使碳的流向从糖、蛋白质的合成转向脂质合成，从而积累虾青素［18］。陈兴才等认为缺氮培养基对于雨生红球藻细胞累积虾青素最为有利，虾青素含量达到6.72 μg/mL［19］。杨瑾等研究发现当完全无氮时，胁迫程度最高，虾青素积累最快，含量最高可达10 μg/mg以上［20］。Ngoc-Phuong Tran等实验证明缺氮处理后3 d，虾青素含量可从91 mg/L增至406 mg/L［21］。而Junfeng Wang等研究了室外条件下，缺氮和藻细胞初始浓度双因素的协同影响，他们发现当初始浓度为0.8 g/L、完全缺氮时，最大虾青素干重含量可达3.8%［22］。

2.2碳

充足的碳源对虾青素的积累也同样非常重要，由于二氧化碳是藻类自养培养时能够保证供给的常规碳源，因此研究人员大都倾向于添加异养培养的有机碳源，包括醋酸盐和葡萄糖等。董庆霖等对乙酸钠诱导虾青素积累的代谢机理进行了比较深入的研究［23］，认为乙酸钠的代谢比二氧化碳固定相对简单，不需要启动复杂的光合作用系统，可通过乙醛酸循环直接进入糖异生途径，而且乙酸钠能够降低Rubisco酶活性，抑制叶绿素和叶绿素结合蛋白的合成，提高硝酸还原酶活性，造成氮饥饿和碳饥饿，促使虾青素的积累。实验结果表明，当乙酸钠浓度为2.0 g/L时，虾青素含量能够达到1.36 mg/g。高政权等研究了Fe2+、醋酸盐和双氧水这三种因子的复合影响，认为Fe2+和醋酸盐的组合可以使虾青素积累更快［24］。Yingxue Su等发现在高光照下，醋酸盐和Fe2+胁迫均可提高虾青素浓度，其中使用450 μmol/L的Fe2+培养2 d后虾青素的含量最高，达到了3.44 μg/mL［25］。游泳等则尝试了发酵行业常用的葡萄糖，发现混合培养条件下葡萄糖添加量为3.161 6 g/L时，虾青素产量为41.06 mg/L，是自养培养时的2.02倍［26］。

2.3其他营养物质

在早期研究中，研究人员发现添加VB1、VB12、VH均能显著促进雨生红球藻细胞的生长［27］。凌善锋等进一步研究表明，雨生红球藻生物量随着VB6浓度的增加而提高，当维生素浓度为120 μg/L时，藻细胞生物量最大，比对照高3.46%［28］。王丽丽等向培养基中添加花生四烯酸，结果表明当花生四烯酸质量浓度为312.5 mg/L时，虾青素的含量最高，达3.67 mg/L［29］。

3外源试剂因素

除了参与构成藻细胞本身的各种营养元素，人们还广泛尝试了许多外源试剂，包括植物激素、抗生素等。李哲等发现低质量浓度的稀土元素Ce3+对微藻生长和虾青素积累均具有明显的促进作用，当Ce3+的质量浓度为1 mg/L时，虾青素质量分数可达到细胞干质量的3.2%［30］。张跃群等采用氮饥饿与亚甲基蓝2种诱导因子取得了类似氮饥饿与高光胁迫类似的结果，他们认为高光胁迫与亚甲基蓝可能具有类似的作用机理［31］。Yandu Lu使用浓度为20 mg/L的茉莉酸甲酯、赤霉素分别处理雨生红球藻取得了比较显著的效果，虾青素浓度可达到4.5 mg/g和6.5 mg/g以上［32］。Ngoc-Phuong Tran等则选取了一种非特异性蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，通过添加浓度为2.5 mmol/L的正钒酸钠，虾青素含量可高达10.7 mg/g［33］。高政权、孟春晓等在外源试剂方面做了大量研究，他们先后使用了水杨酸、乙烯、萘乙酸、赤霉素、植物生长调节剂920等，取得了一系列正向研究结果［34-39］。但由于成本和利用效率的问题，外源试剂的处理方式还未能实际应用于大规模生产天然虾青素。

4展望

雨生红球藻是自然界中虾青素含量最为丰富的生物，其虾青素具有100%的左旋（3S，3'S）结构，能呈现出最强的生物学活性，所以利用雨生红球藻生产天然虾青素受到世界各国食品、保健品、药品工业等的广泛关注。先藻细胞增殖、再虾青素积累的两步法仍然是目前最成熟的工艺，促使虾青素积累的诱导也仍然主要集中在高光照强度、高温、缺氮等传统典型胁迫条件，但近年开始越来越倾向于这些方法的复合作用，同时也进行了异养培养、添加外源试剂、补充其他营养元素等多种尝试，均取得了比较明显的正向结果，对今后天然虾青素生产的工业化发展将起到良好的促进作用。

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Influences of Multiple Factors on Accumulation of Astaxanthin in Haematococcus pluvialis

MA Xin-xin，SHI Lei，YANG Qiao-li，GENG Jin-feng，FENG Qian，TENG Jie，ZHAO Yan-peng，WANG Yan，LIU Min-sheng*
（State Key Laboratory of Coal-based Low Carbon Energy，ENN Science&Development Co.，Ltd.，Langfang 065001，Hebei，China）

Astaxanthin is one of the most effective natural antioxidants due to its unique molecular structure and biological activity.At present，natural astaxanthin was produced by Haematococcus pluvialis as a two-step process involving microalgae proliferation and accumulation.The stress-induced method for accumulating astaxanthin was concentrated under high intensity lighting，elevated temperatures，nitrogen deficiency and other environmental stress conditions.These techniques were further refined and compounded to enhance its effectiveness over the last few years.Additional developments such as heterotrophic culture，the introduction of foreign sourced reagents and nutrients had also come into standardized practice.

Haematococcus pluvialis；astaxanthin；accumulation；stress

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.048

2015-05-25

马欣欣（1978—），男（汉），助理研究员，硕士，从事微藻养殖与光反应器制造等方面研究。

刘敏胜（1978—），男（汉），副研究员，博士。