脉冲电流经皮刺激运动疲劳大鼠肝区对肝的影响＊

朱履刚，黄昌林，常祺

基础医学

脉冲电流经皮刺激运动疲劳大鼠肝区对肝的影响＊

朱履刚，黄昌林，常祺＊

目的探讨脉冲电流经皮刺激肝区对运动疲劳大鼠肝的影响。方法72只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、疲劳组和刺激组，每组24只。疲劳组和刺激组进行游泳训练，建立运动疲劳模型，刺激组训练后给予大鼠肝区脉冲电流（1024Hz，10mA）刺激，于第1、3、5周训练结束后禁食水24 h，处死动物，心脏采血，检测肝功能相关指标，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、乳酸（LD）及乳酸脱氢酶（LDH）。采用免疫组化方法测定大鼠肝组织Bcl-2和Bax的表达分布。结果第1、3、5周末三组血TBIL及TP含量均无显著性差异，刺激组血LDH含量明显低于疲劳组（P＜0.05）；血ALT、AST及LD含量第1周末疲劳组明显高对照组及刺激组（P＜0.05），而对照组和刺激组无显著差别，第3、5周末疲劳组明显高于对照组及刺激组（P＜0.05）。第1周末三组大鼠肝组织Bcl-2表达无明显差别（P＞0.05），第3周末刺激组肝组织Bcl-2表达明显高于疲劳组（P＜0.05），但与对照组比较无显著差异（P＞0.05），第5周末刺激组肝组织Bcl-2表达明显低于对照组（P＜0.05），但高于疲劳组（P＜0.05）；刺激组大鼠肝组织Bax表达在第1周末与对照组比较无显著差异（P＞0.05），随后开始显著高于对照组（P＜0.05），但在各时间的均显著低于疲劳组（P＜0.05）；第1、3、5周疲劳组Bcl-2/Bax均显著低于对照组和刺激组（P＜0.05），而第3、5周时刺激组亦显著低于对照组（P＜0.05）。结论运动性疲劳可以增加Bax蛋白在肝细胞的表达，减少Bcl-2表达，诱导细胞凋亡，引起肝组织损伤；经皮脉冲电流刺激运动性疲劳大鼠肝区，能降低Bax在肝中的表达，增加Bcl-2的表达，显著减少运动性疲劳的肝损害，有延缓运动性疲劳的发生，促进运动性疲劳的恢复，加速乳酸清除等作用。

脉冲电流；疲劳；肝；蛋白质；Bcl-2；Bax

细胞的程序性死亡又被称为细胞凋亡，需要启动特殊的基因，转录和合成细胞内的特定蛋白质，Bcl-2家族成员的一类蛋白质在细胞凋亡过程中起到重要作用［1，2］。有研究表明，大鼠肝细胞凋亡数量随运动强度的增加显著增加［3］。本项研究中，笔者建立了运动性疲劳大鼠模型，通过脉冲电流经皮刺激大鼠肝区，观察肝相关指标变化及大鼠肝细胞凋亡蛋白Bcl-2，Bax蛋白的表达，以此研究脉冲电流抗疲劳的作用机制。

1　材料与方法

1.1动物模型制备健康雄性8周龄Wistar大鼠72只（河南省实验动物中心提供），体重（195±8）g，适应性喂养7 d，随机分为对照组、疲劳组和刺激组，每组24只。按组进行分笼，饲养室温度为23℃，湿度为60%，自然光照，自由摄食、饮水。实验开始前7 d，每只大鼠每天学习游泳25min，水温（35±1）℃，水深70 cm，随后连续进行5W实验。疲劳组和刺激组每周进行游泳训练6 d，休息1 d，游泳2次/d，1 h/次，当大鼠浮在水面不运动时用木棒驱赶，使其维持运动状态。每组大鼠游泳后换水。大鼠游泳训练结束后，用60W的灯迅速烘干大鼠的被毛。每组在游泳后均给予腹腔注射盐酸氯胺酮注射液0.25 g/kg麻醉。刺激组在游泳后给予大鼠肝区电刺激，频率1 024Hz，强度10mA，时间20min。

1.2取材、标本制备及检测指标分别在1、3、5周第7天，大鼠禁食水24 h，分批麻醉处死（每组每时间点8只），心脏采血，检测肝功能相关指标，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、乳酸（LD）及乳酸脱氢酶（LDH）。立即取部分肝右叶以10%中性多聚甲醛固定24～48 h，常规石蜡包埋切片，脱蜡至水，采用Bcl-2及Bax免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）检测Bcl-2及Bax表达，具体操作严格按说明书操作，PBS代替一抗作为阴性对照。FULINON HC-300系统采集图像，Image pro plus 4.1软件分析图像。每只动物选3张切片，每张切片随机选取不重复的6个视野（×400）进行积分光密度值（IOD）定量分析。

2　结果

2.1脉冲电流经皮刺激肝区对运动疲劳大鼠肝功能的影响第1、3、5周末三组大鼠血液中TBIL及TP含量无显著性差异（P＞0.05）。第1周末对照组及刺激组血液中LDH含量无显著性差异，但均低于疲劳组（P＜0.05）；第3、5周末刺激组血液中LDH含量低于疲劳组（P＜0.05）、高于对照组（P＜0.05）。第1周末疲劳组血ALT、AST及LD含量明显高于其他两组（P＜0.05），对照组和刺激组无显著性差异；第3、5周末疲劳组血ALT、AST及LD含量明显高于其他两组（P＜0.05），刺激组明显高于对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2脉冲电流对疲劳大鼠肝组织Bcl-2和Bax表达的影响第1周末三组大鼠肝组织Bcl-2表达无明显差别（P＞0.05），第3周末刺激组肝组织Bcl-2表达明显高于疲劳组（P＜0.05），但与对照组比较无显著差异（P＞0.05），第5周末刺激组肝组织Bcl-2表达明显低于对照组（P＜0.05），但高于疲劳组（P＜0.05）；疲劳组大鼠肝组织Bax表达在第1、3、5周末均显著高于对照组和刺激组（P＜0.05），刺激组大鼠肝组织Bax表达第1周末与对照组无显著差异，而第3、5周末显著高于对照组（P＜0.05）；疲劳组大鼠肝组织Bcl-2/Bax比值在第1、3、5周末均显著低于对照组和刺激组（P＜0.05），刺激组大鼠肝组织Bcl-2/Bax比值第1周末与对照组无显著差异，而第3、5周末显著低于对照组（P＜0.05，表2）。

表1　各组大鼠血TBIL、TP、LDH、ALT、AST及LD的含量（±s，n=8）

表1　各组大鼠血TBIL、TP、LDH、ALT、AST及LD的含量（±s，n=8）

注：与对照组比较，＊P＜0.05；与运动训练组比较，#P＜0.05；

项目训练时间（周）1 3 5 TBIL（μmol/L）对照组1.16±0.19 1.15±0.17 1.09±0.10疲劳组1.14±0.21 1.13±0.22 1.09±0.11刺激组1.20±0.24 1.10±0.22 1.09±0.11 TP（g/L）对照组47.49±8.35 49.78±5.49 50.91±5.90疲劳组48.59±8.92 49.44±7.06 49.02±8.09刺激组50.60±10.00 49.40±7.49 50.78±7.03 LDH（U/L）对照组1060±104 1057±96 1058±99疲劳组1336±127＊1477±105＊1831±106＊刺激组1072±93#1185±125＊#1422±112＊#ALT（U/L）对照组38.62±3.11 38.75±2.92 38.88±2.70疲劳组58.25±5.82＊65.38±5.12＊73.00±6.37＊刺激组39.50±5.04#46.00±5.34＊#58.62±7.00＊#AST（U/L）对照组107.3±13.0 108.9±16.1 106.5±13.8疲劳组149.9±14.3＊169.3±14.6＊187.3±16.1＊刺激组110.1±9.9#128.0±20.0＊#153.5±11.6＊#LD（mmol/L）对照组6.52±1.99 6.38±1.99 6.33±1.94疲劳组14.75±2.56＊18.89±2.50＊22.18±2.14＊刺激组8.05±1.80#12.69±1.95＊#16.04±1.97＊#

表2　各组大鼠Bcl-2和Bax的积分光密度值及其比值的比较（±s，n=8）

表2　各组大鼠Bcl-2和Bax的积分光密度值及其比值的比较（±s，n=8）

注：与安静对照组比较，＊P＜0.05；与运动训练组比较，#P＜0.05

时间Bcl-2（IOD值）Bax（IOD值）Bcl-2/Bax第1周末对照组63.40±6.73 68.42±5.84 0.93±0.03疲劳组61.21±5.65 89.95±6.41＊0.68±0.03＊刺激组62.89±5.04 68.03±6.06#0.93±0.04#第3周末对照组65.38±3.96 69.86±5.03 0.94±0.03疲劳组54.39±5.68＊107.99±4.69＊0.50±0.04＊刺激组61.60±5.79#92.63±9.53＊#0.67±0.06＊#第5周末对照组62.71±4.26 67.86±4.53 0.92±0.04疲劳组48.10±5.05＊120.08±4.08＊0.40±0.05＊刺激组54.43±4.84＊#109.64±7.03＊#0.50±0.04＊#

3　讨论

肝是人体的重要器官，具有各种代谢功能。血清ALT和AST增加在某种程度上反映了肝的破坏程度。肝细胞损伤时，肝细胞膜通透性升高，ALT和AST进入血液，导致血清ALT和AST升高。本研究结果显示，在整个实验过程中除AST和ALT外三组其他肝功能指标无显著差异。大鼠疲劳组血清AST和ALT明显较刺激组升高（P＜0.05），表明电刺激可以减少运动疲劳造成的肝损伤。当高强度运动时，LDH大量溢出细胞导致血清LDH活性增高，所以血清LDH能够反映过度训练对机体组织的损伤轻重［4］。本研究结果表明，刺激组的LDH水平在各个时间点上与疲劳组相比较均明显降低。LD作为体内糖原无氧代谢的最终产物，其增加导致肌肉内氢离子浓度增加，使pH值下降，从而产生一系列生化反应，是疲劳发生的主要原因之一［5］。LD新陈代谢加速是防止运动性疲劳产生，提高运动能力的一个重要方法［6］。本研究结果显示，疲劳组血清乳酸含量较刺激组显著升高（P＜0.05），可见采用脉冲电流经皮刺激大鼠肝区能明显降低血清乳酸含量。

在多细胞生物个体中，肝细胞凋亡对个体正常发育、维持内环境稳定以及抵抗外界各种干扰等方面起着关键作用［7-9］。异常的肝细胞凋亡在急性和慢性肝损伤的发病机制中起重要作用［10］。细胞凋亡有两个重要调控基因的表达产物，包括Bcl-2和Bax。其中Bax的过高表达导致细胞凋亡，而Bcl-2是拮抗作用。Bcl-2和Bax蛋白的比例是决定细胞凋亡发生率的一个关键因素［11］。Bax表达占主导地位，细胞凋亡大于增值，反之则表现为增值，从而影响机体的功能。本研究结果显示，刺激组Bax的表达从第3周末起即明显高于对照组，但低于疲劳组；Bcl-2的表达仅在第5周末低于对照组，但仍高于疲劳组，余时间点和对照组无明显差别，而Bcl-2/ Bax比值各时间点均明显高于疲劳组，提示脉冲电流经皮刺激大鼠肝区可明显降低Bax的表达，增加Bcl-2的表达，提高Bcl-2和Bax蛋白的比例，对肝细胞产生保护作用。

综上所述，运动性疲劳可以增加Bax蛋白在肝细胞的表达，减少Bcl-2表达，诱导细胞凋亡，引起肝组织损伤；经皮脉冲电流刺激大鼠肝区，能降低Bax在肝的表达，增加Bcl-2的表达，从而提高Bcl-2和Bax蛋白的比例，抑制肝细胞过度凋亡，显著减少运动性疲劳的肝损害，有延缓运动性疲劳的发【参考文献】

生，促进运动性疲劳的恢复，加速乳酸清除等作用。

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［2015-05-11收稿，2015-06-10修回］

［本文编辑：韩仲琪］

Influence of the percutaneous impulsive current stimulation on hepatic area in exercise-induced fatigue rats

ZHU Lv-gang①，HUANG Chang-lin，CHANG Qi.①Dept.of Orthopedics，No.150 Hospital of Chinese PLA，Luoyang，Henan 471031，China

Objective To study pulsed current transcutaneous stimulation effects on hepatic area in exercise-induced fatigue rats.M ethods The 72 male Wistar rats were random ly divided into three groups：control group（n=24），exercise training group（n=24）and stimulating group（n=24）.The exercise training group and the stimulating group were given swimming training to establish exercise-induced fatigue models，and then impulsive current stimulation was given to the stimulating group.At the 1st，3rd，and 5th weekend，deprived of eating and drinking for 24 hours，then 8 rats of each group were randomly chosen and sacrificed，then the blood was drawn from the heart to measure the level of hepatic function，such as alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），total bilirubin（TBIL），total protein（TP），lactic acid（LD）and lactate dehydrogenase（LDH）. And the immunohistochemical method was used to determine the Bcl-2 and the Bax expression and distribution of the rat’s hepatic tissue.Results 1）At the 1st，3rd，and 5th weekend，three groups rat’s TBIL and TP content were not of remarkable difference in statistics（P＞0.05），stimulating group LDH content obviously lower than training group（P＜0.05）；At the 1st week end，the ALT，AST and LD contents of the exercise training group was higher than the stimulating group and the control group（P＜0.05），but control group and stimulating group is no significantly difference（P＞0.05）.At the 3rd and 5th weekend，exercise training group was higher than control group and the stimulus group（P＜0.05）；2）At the 1st weekend，the rat’s hepatic Bcl-2 expression of each group was not of remarkable difference in statistics（P＞0.05）.At the 3rd weekend the rat’s hepatic Bcl-2 expression of the stimulating group and the control group were not of remarkable difference in statistics（P＞0.05），but higher than the exercise training group（P＜0.05）.At the 5th weekend，the rat’s hepatic Bcl-2 expression of the stimulating group was higher than the exercise training group（P＜0.05）and lower than the control group（P＜0.05）.The rat’s hepatic Bax expression of the stimulating group and the control group were not of remarkable difference in statistics（P＞0.05）at the 1st weekend，and then it was higher than the control group（P＜0.05）but lower than the exercise training group（P＜0.05）.The rat’s hepatic Bcl-2/Bax of the exercise training group is lower than the control group and the stimulating group（P＜0.05）at the 1st，3rd，5th weekend.Conclusion The exercise-induced fatigue causes obvious elevation of Bax expression and obvious reduction of Bcl-2 expression in hepatic cell，which inducing the hepatic cell to apoptosis and consequently damaging the hepatic organization.The percutaneous impulsive current stimulation to the hepatic area of exercise-induced fatigue rat can reduce Bax expression and elevate the Bcl-2 expression to protect the normal construction of hepatic tissue.The suitable frequency of impulsive current stimulation can reduce the hepatic damage due to exercise-induced fatigue.In the exercise-induced fatigue developing process，it also can delay exercise-induced fatigue occurrence，promote exercise-induced fatigue oration，and accelerate lactic acid elimination，and so on.

Impulsive current；Fatigue；Liver；Protein；Bcl-2；Bax

基础医学

R442.9：R454.1

A

全军卫生和疾病防控应用性研究指令性课题《现代军事作业中健康保护及军事训练伤诊断防治技术的研究》13BJY18

471031河南洛阳，解放军150医院骨科（朱履刚，黄昌林），全军军事训练医学研究所（常祺）

常祺，Email：changqi1127@gmail.com