创伤失血性MODS患者外周血单核细胞核因子-κB表达与预后的关系

张颖，王晓荣

临床医学

创伤失血性MODS患者外周血单核细胞核因子-κB表达与预后的关系

张颖，王晓荣＊

创伤失血性休克；单核细胞核因子-κB；预后

创伤失血性休克是临床常见的危重症之一，许多因素参与了其病理过程。特别是免疫/炎症反应的失控，促炎细胞因子的大量释放和抗炎反应过度强烈均可导致MODS［1］。因此对机体炎症反应的深刻认识有利于早期认识MODS病理生理紊乱，使其早期积极干预成为可能。本研究对创伤失血性MODS患者外周血单核细胞核内核因子-κB（NF-κB）的表达和血清IL-6、TNF-a水平进行检测，旨在探讨他们的变化在MODS病情发生、发展中作用，为临床对MODS辅助临床诊断、病情监测及预后提供依据。

1　资料与方法

1.1一般资料2010年2月—2013年12月郑州大学第五附属医院ICU收治的各种创伤失血性MODS患者40例，均符合1995年全国危重病急救医学学术会议指定的MODS病情分期的诊断标准和严重程度评分标准［2］。其中男26例，女14例；年龄23～65岁，平均45岁；平均24 h失血＞1000ml，MODS病情评分为（13.54±3.89）分；死亡18例为创伤失血性MODS死亡组，MODS病情评分为（18.89±3.67）分；生存22例为创伤失血性MODS生存组，MODS病情评分为（11.34± 3.34）分。正常对照组为与MODS年龄、性别相匹配的健康体检者40例，其中男25例，女15例；年龄23～64岁，平均43岁。上述参与者均排除自身免疫性疾病、哮喘和过敏性疾病或感染性疾病等，MODS患者均没有接受抗肿瘤药物、放射和免疫抑制药治疗。

1.2试验方法

1.2.1静脉血抽取MODS患者于确诊＜24 h、24～48 h、48～72 h、＞72 h抽空腹静脉血5ml，正常对照组均抽取空腹静脉血5m l，分别放入加抗凝剂的Falcon（12mm×75mm）试管内，1 h内送检。

1.2.2单核细胞悬液制备①取抗凝血100μl加入等量FACS溶解剂，室温20min，加PBS缓冲液漂洗一次。②立即加入250μl溶解液A 200μl、溶解液B和RNAase A，室温10min，1 500 r/min离心5min，弃上清液，即得单核细胞悬液。

1.2.3计数和染色向制备好的单核细胞悬液中加入PBS缓冲液0.5m l，调整细胞数为1×106/ml。用血红蛋白吸管吸取单核细胞悬液10μl置于载玻片的一端，涂片，采用Wright-Giemsa法染色，镜下确证制备的悬液为单核细胞悬液。

1.2.4单核细胞培养将各组所分离的单核细胞分别用适量RPMI1640培养基混匀后置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱培养24 h，弃掉非贴壁细胞，将细胞浓度调至1×109个/L，分别加入24孔板内，置37℃体积分数为5%CO2培养箱培养12 h，留取细胞并收集上清液。

1.2.5 NF-κB的活性检测制备各组单核细胞核蛋白提取物，测定蛋白浓度；含κB序列（5＇-AGC TTC AGA GGG GAC TTT CCG AGA GG-3＇，3＇-AGT CTC CCC TGA AAG GCT CTC TCC AGCT-5＇）的两条寡核苷酸单链退火后结合成双链探针，在DNA聚合酶klenow大片段催化下，用α32-Pd-CTP（亚辉公司产品）标记探针3＇端，纯化后用凝胶电泳迁移率改变分析法检测NF-κB活性。将图片进行密度扫描（数值以总灰度的对数表示），对NF-κB活性进行半定量分析。

1.2.6血清和培养上清液IL-6、TNF-a水平检测采用放射免疫分析法测定，试剂购自北京东亚免疫技术研究所，按说明书操作，仪器为FJ2008G自动免疫计数器。

2　结果

2.1不同时间段对照组和MODS组外周血单核细胞核内NF-κB活性表达对照组外周血单核细胞核内NF-κB活性表达随时间变化波动较小均保持在低水平（59.21±11.02）。MODS组在＜24 h、24～48 h、48～72 h、＞72 h时间段外周血单核细胞核内NF-κB活性表达分别为（666.58±137.18）（893.34±195.438）（751.52±176.36）（523.56±158.22），与对照组同一时间段外周血单核细胞核内NF-κB活性表达比较（表1），差异均有统计学意义P均＜0.01。MODS组患者外周血单核细胞核内NF-κB活性表达在24～48 h达到峰值，随后逐步降低。

表1　不同时间外周静脉血单核细胞核内NF-κB活性表达比较（±s）

表1　不同时间外周静脉血单核细胞核内NF-κB活性表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01

NF-κB时间段＜24 h 24～48 h 48～72 h＞72 h对照组40 60.55±12.01 60.33±11.89 58.44±12.21 58.46±11.87 MODS组40 666.58±137.18*893.34±195.43*751.52±176.36*523.56±118.22*组别n

2.2不同时间段对照组和MODS组细胞培养上清液和血清IL-6、TNF-a水平的变化对照组细胞培养上清液和血清IL-6、TNF-a水平随时间变化波动较小均在正常范围，各时间段比较差异无统计学意义P均＞0.05。MODS组患者在＜24h、24～48 h、48～72 h、＞72 h时间段细胞培养上清液和血清IL-6、TNF-a水平与对照组同一时间段IL-6、TNF-a水平比较，差异均有统计学意义P均＜0.01。MODS组患者细胞培养上清液和血清IL-6、TNF-a在48～72 h达到峰值，随后有逐步降低趋势，见表2。

表2　两组IL-6、TNF-a水平比较（±s）

表2　两组IL-6、TNF-a水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01

MODS组IL-6（μg/L）TNF-a（ng/L）IL-6（μg/L）TNF-a（ng/L）＜24 h（n=40）上清液17.13±3.65 23.23±4.12 481.34±165.36*214.15±84.34*血清16.52±3.32 22.14±4.33 105.65±39.45*123.34±34.25*24～48 h（n=40）上清液17.32±3.54 24.45±4.79 532.13±157.87*223.59±90.63*血清16.12±3.23 21.22±4.32 145.54±49.45*125.68±34.56*48～72 h（n=40）上清液17.24±3.48 23.56±4.71 612.31±189.63*258.71±89.68*血清16.34±3.15 21.32±4.22 165.32±45.21*126.24±34.65*＞72 h（n=40）上清液17.32±3.34 23.61±4.56 591.65±179.28*236.76±86.36*血清16.42±3.22 22.12±4.31 163.21±43.23*126.12±34.10*时间对照组

2.3患者MODS评分、NF-κB、IL-6和TNF-a的变化与预后的关系死亡组患者MODS评分明显高于生存组患者，差异有统计学意义P＜0.01；MODS组死亡患者外周血单核细胞核内NF-κB活性表达（686.58±148.12）与生存组患者（346.34±106.43）比较显著升高，差异有统计学意义P＜0.01；MODS组死亡患者细胞培养上清液和血清IL-6含量与生存组患者比较显著降低，差异均有统计学意义P均＜0.01；MODS组死亡患者细胞培养上清液和血清TNF-a含量与生存组患者比较，差异均有统计学意义P均＜0.05，见表3。

表3　各组MODS评分、NF-κB、IL-6和TNF-a比较（±s）

表3　各组MODS评分、NF-κB、IL-6和TNF-a比较（±s）

注：与生存组比较*P＜0.01

组别TNF-a（ng/L）IL-6（μg/L）NF-κB MODS评分死亡组（n=18）上清液325.57±98.56*761.68±169.32*686.58±148.12*18.89±3.67*血清154.72±65.26*255.6±98.1*生存组（n=22）上清液116.71±79.37*521.36±149.12*346.34±106.43 11.34±3.34血清99.56±55.15 94.2±68.5

2.4 MODS评分与NF-κB、IL-6和TNF-a的相关性分析经spearman相关分析显示，MODS组患者的MODS评分与细胞培养上清液和血清IL-6和TNF-a含量无明显相关性；而与外周静脉血单核细胞核内NF-κB活性表达呈明显正相关关系r=0.4564，P＜0.05。细胞培养上清液和血清中TNF-a含量与IL-6含量间呈明显正相关关系r1=0.5869，P＜0.01；r1= 0.5102，P＜0.01。

2.5影响MODS患者外周血单核细胞NF-κB活性、细胞培养上清液和血清IL-6和TNF-a水平的危险因素Logistic回归分析对影响MODS患者外周血单核细胞NF-κB活性、细胞培养上清液和血清IL-6和TNF-a水平的危险因素Logistic回归分析显示，严重感染，胃肠道损伤，感染并发症、严重创伤均是影响患者外周血单核细胞NF-κB活性、细胞培养上清液和血清IL-6和TNF-a水平的危险因素，见表4。

表4　影响MODS患者IL-6和TNF-a水平的危险因素Logistic回归分析结果

3　讨论

随着对创伤后并发症的发生发展认识的不断深入，创伤/SIRS/MODS/MOF/死亡作为创伤并发症的演变过程已达成共识［3］。创伤后并发症如感染、ARDS和MODS等的发生率及其引发的死亡率仍居高不下，主要原因为上述并发症发展速度极快。特别是病情发展到MOF阶段，即使采取最及时的治疗措施都难以遏止其发展进程［4］。因此如能早期实施干预措施，对逆转并发症的演变和降低病死率都有重要意义。

NF-κB蛋白是一种化学上高度保守的免疫反应蛋白，由Rel蛋白家族的两位成员组成。Rel蛋白间可形成多种形式的同源或异源二聚体，其中以p50/p65最为典型，几乎存在于体内所有细胞，但是p65 C端含有一个以上反式激活区，具有激活靶基因转录的功能。NF-κB未激活时以二聚体与IκB单体偶联，当细胞接受胞外刺激信号（如脂多糖、TNF-a、氧自由基等）后NF-κB激活迅速由胞浆向胞核移位，并与核内相应DNA上κB序列结合，通过调控单核巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等多种细胞炎性因子过度表达释放，通过“扳机样作用”触发炎性因子的“瀑布样效应”［5］。

在严重创伤或出血性休克的情况下，有效血容量明显减少，心输出量明显下降，血液灌流不足，微循环障碍，从而直接影响主要脏器如脑、心、肺、肝、肾等的功能［6］。在失血性休克大鼠病理过程中，肝组织在伤后NF-κB迅速表达，伤后6 h达到峰值，伤后8 h仍维持较高水平，NF-κB持续高表达一直维持在肝这一病理过程的始终，表明NF-κB在创伤失血性休克伤后肝继发性损害中扮演着重要角色，参与了肝损伤的发生［7］。同样的研究发现，在失血性休克鼠模型的肺组织细胞中NF-κB的活性在短期内立即升高，随后各种细胞因子的含量也明显增加，炎症介质的大量释放产生瀑布样反应，导致脓毒症，甚至脏器功能不全和多脏器功能障碍综合征（MODS）［8-10］。

MODS是严重创伤后主要并发症和死亡原因之一。研究表明NF-κB的活化在创伤后MODS的发生中具有十分重要的作用，处于信号转导的核心地位［11］。大量的动物实验均表明严重创伤的早期已可诱导NF-κB的活化。在LPS引起的MODS大鼠模型中，显示在NF-κB启动子控制下可表达虫荧光素酶DNA：LPS刺激时，NF-κB活化表现为器官特异性和时间依赖性。给予LPS 1～2 h后，可诱导肝NF-κB活化，2 h后使肺NF-κB活化，以及1～4 h激活脾中的NF-κB。在给予LPS 6 h后，可发现肺NF-κB依赖性细胞因子mRNA和血清细胞因子增加，24 h后可发现粒细胞性肺泡炎的组织学证据。这些结果提示NF-κB在急性肺损伤发病中的重要作用。在采用盲肠结扎或穿孔制成的鼠脓毒血症模型中，3 h后可在肝和肺中检测到早期激活的NF-κB。对鼠全身应用胰酶后，肺炎症反应与NF-κB在肺内的活性增加有关，可解释急性胰腺炎时出现全身性炎症反应的机制。总之，越来越多的证据显示，NF-κB参与了MODS的发生和发展［12］。

Altavilla等［13］在失血性休克小鼠模型中发现休克早期即出现肺、肝、脑细胞NF-κB的活化，提示NF-κB为MODS病理生理变化的启动因子。Paterson等［14］发现危重患者中性粒细胞和单核细胞的NF-κB活性远较健康人的高，在10例患者中，存活96 h的患者单核细胞NF-κB活性不变，而4例死亡者在死亡前的NF-κB活性则较存活者的明显增加。同时血IL-6，IL-8和细胞间黏附分子-1升高，但与NF-κB活性无关。Foulds等［15］研究发现，术后发生MODS的患者外周血单核和中性粒细胞中NF-κB的活性明显高于未发生MODS的患者，死亡患者的NF-κB水平高于存活者。Bohrer等［14］观察到败血症休克患者外周血单个核细胞NF-κB的结合力增加，且所有6 d内死亡病例的第1天NF-κB活性均高于基础值2倍以上，并显示NF-κB活性与APACHE-II评分呈明显正相关。有研究显示，MODS组各时点外周血单个核细胞NF-κB活性明显高于正常对照组，以第3天为最高点，说明MODS早期存在NF-κB的活化增多；NF-κB活性在存活组呈降低的趋势而死亡组维持在高水平，提示持续高水平的NF-κB活性预示预后不良。

本资料结果显示，对照组外周血单核细胞核内NF-κB活性表达随时间变化波动较小，均保持在低水平，而创伤失血性MODS组患者外周血单核细胞在24 h内就有NF-κB的强烈表达，这可能是细胞受到氧化剂、细菌、毒素等刺激后，IκB经历快速和大量的磷酸化后被非特异性蛋白酶水解，导致胞浆内NF-κB大量快速向核内转移，结合在被诱导基因启动子序列上与之对应的κB位点，并促进基因转录蛋白质，24～48 h达到峰值。同时结果还显示MODS组死亡患者外周血单核细胞核内NF-κB活性表达明显高于生存组，MODS患者的MODS评分与NF-κB表达呈明显正相关。提示患者早期外周血单核细胞核内NF-κB明显激活。动物模型［16］研究发现，使用NF-κB拮抗药可抑制NF-κB激活。若临床能早期适度应用NF-κB抑制药，抑制NF-κB激活，阻止炎症介质的大量表达和释放，对防止MODS的发生可能会起一定作用。

同时资料结果还显示，创伤失血性MODS组患者细胞培养上清液和血清IL-6、TNF-a含量明显高于正常对照组，MODS组死亡患者细胞培养上清液和血清IL-6、TNF-a含量明显高于生存组，MODS患者的MODS评分与者细胞培养上清液和血清IL-6、TNF-a含量之间无明显相关性，但细胞培养上清液和血清TNF-a含量与IL-6含量间呈明显正相关关系，说明急性失血致循环血量骤减而发生的一种低血容量性休克，并导致各脏器有效血流灌注不足及缺血性损害。随着缺血时间的延长，机体会发生一系列连锁反应，如内毒素移位、炎性因子的合成与释放，形成炎症瀑布反应，使组织器官损害发展加重［17］。提示IL-6、TNF-a在MODS发生、发展中发挥着重要作用。因此动态监测它们的变化可作为病情的发展趋势的一个辅助指标。

总之，创伤失血性休克并发MODS可导致外周血单核细胞NF-κB活性、IL-6、TNF-a含量的显著变化，其变化与MODS病情发展和患者预后密切相关，因此动态监测它们的变化对创伤失血性MODS的发生、发展及病情转归具有一定预警作用。推测临床能早期适度应用NF-κB抑制药，抑制NF-κB激活，阻止炎症介质的大量表达和释放，将对于防止MODS的发生提供新的治疗途径。

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［2015-03-06收稿，2015-04-02修回］

［本文编辑：宋敏］

R541.6+4

B

451150河南新郑，河南省军区教导大队卫生所（张颖）；250002山东济南，济南军区联勤部干休一所（王晓荣）

王晓荣，Email：rong61181@163.com