一种简便高效提取两栖动物肌肉组织基因组DNA的方法

李佳璇，陈 卓，朱艳军，何玉晓，陈晓虹

（河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007）

在动物的系统发育研究中，动物标本采集和组织样本保存是研究的基础，提取一定浓度和高质量的基因组DNA是影响实验结果的关键.在两栖动物野外考察和标本采集过程中，为获得大数据样本，避免标本腐烂和DNA降解，取肌肉组织于体积分数95%的乙醇溶液中固定是样本保存的有效方法[1-2].在DNA提取过程中，彻底去除肌肉组织中的乙醇，以蛋白酶K裂解组织细胞，采用酚-氯仿抽提是最经典和常规的方法[3]，具有成本低、有效去除蛋白、DNA纯度高、可满足各种实验要求等优点[4]，但实验耗时长、效率低的特点也较突出.为此本研究介绍一种简单、高效提取两栖动物肌肉组织基因组DNA的方法.

1 材料与方法

1.1 材料

臭蛙属（Odorrana）的6个物种：大绿臭蛙（Odorrana graminea）、花臭蛙（O.schmackeri）、宜章臭蛙（O.yizhangensis）、合江臭蛙（O.hejiangensis）、黄岗臭蛙（O.huanggangensis）、海南臭蛙（O.hainanensis）.肌肉组织作为实验材料，以体积分数为95%的乙醇溶液固定，－20℃冰箱保存.

1.2 试剂

裂解缓冲液：体积分数10%的SDS，0.5 mol/L的EDTA（pH 8.0），1 mol/L 的 Tris-HCL（pH 8.0）.

其他：20 g/L蛋白酶K，Tris-平衡酚，氯仿异戊醇混合液（体积比为24∶1），体积分数95%的无水乙醇，3 g/L的NaAc，灭菌双蒸水.

1.3 方法

常规酚-氯仿抽提法[3]稍加改进.

脱醇：取50 mg肌肉组织放入1.5 mL Eppendorf管中，加灭菌双蒸水，用灼烧过的剪刀将肌肉剪碎（越碎越好），每隔30 min更换灭菌双蒸水，总共3次.

消化：吸除Eppendorf管中的双蒸水，加入500μL裂解缓冲液及6～7μL的20 g/L的蛋白酶K，置于55℃水浴锅中消化.在消化的第1h内，每隔10 min混匀1次，加快消化速度.消化时间根据消化程度而定，大约3～4h.

Tris-平衡酚抽提：4℃、5 000 r/min条件下，将消化后的组织液离心5 min，取上清液至新的Eppendorf管中，加入等体积的Tris-平衡酚（约500μL），旋转器上摇匀10 min，在4℃、8 000 r/min条件下离心15 min，上清液移至新的Eppendorf管中.

混合抽提：加入Tris-平衡酚和氯仿异戊醇混合液各 250μL，颠倒混匀 10 min，在 4℃、8 000 r/min条件下离心15 min，取上清液至新的Eppendorf管中.

氯仿异戊醇抽提：加入等体积的氯仿异戊醇，颠倒混匀10 min，4℃、8 000 r/min条件下离心15 min.将上层水相小心转移至新的Eppendorf管中.

沉淀：加入4℃、0.1倍体积浓度为3 mol/L的NaAc（约50μL）、2.5倍体积冷冻的无水乙醇（约1 mL），旋转混匀.置于-20℃冰箱，沉淀3h以上.

保存：在4℃、12 000 r/min条件下离心10 min后弃掉溶液，烘干，加入50μL灭菌双蒸水在4℃冰箱保存.

从样品脱醇到提取基因组DNA，总耗时约12h.

1.4 基因组DNA的检测

取2μL基因组DNA稀释液，用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段大小及降解情况.

1.5 PCR扩增检测

设计2对线粒体12S和16S rDNA引物，进行PCR扩增，反应体系总体积25μL，包括：18.8μL的灭菌双蒸水，2.5μL的 10×buffer，2μL的三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP）溶液，各0.5μL的上游和下游引物，0.5μL的样品DNA，0.2μL的TaqDNA聚合酶.

PCR扩增程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35个循环，72℃延伸10 min.反应结束，取2μL扩增产物于质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测.

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取结果

用改进的方法提取6种臭蛙的肌肉组织DNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测后，基因组DNA条带均清晰、明亮、整齐，如图1所示.

图1 提取臭蛙类肌肉组织基因组DNA电泳结果Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA from muscle tissues of odor frogs

2.2 PCR扩增及检测

利用线粒体引物扩增6种臭蛙的12S、16S rDNA基因片断，琼脂糖凝胶电泳检测后，都表现出单一明亮的条带，如图2所示.

图2 PCR扩增的12Sr DNA和16Sr DNA基因片断Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified 12Sr DNA and 16Sr DNA

3 讨论

目前，国内外常规的基因组DNA提取方法主要有CTAB法[5-7]、异丙醇沉淀法[8]和SDS-蛋白酶K法[3]等，不同提取方法的主要区别在于裂解组织样品的方法不同.其中CTAB法主要采用CTAB抽提缓冲液处理和液氮冷却快速研磨裂解组织样品，主要用于植物和微生物基因组DNA的提取[5-7]；经典的SDS-蛋白酶K法采用SDS抽提缓冲液和蛋白酶K充分裂解组织样品，主要用于动物组织DNA的提取[1-5]，该方法1次提取需耗时2～3 d，大量时间用于去除组织中的乙醇（10～15h）和消化裂解蛋白质（8～14h）.为此，莫邦辉等[9]提取角蟾属蝌蚪尾部肌肉的DNA时，尝试不经蛋白酶K消化，直接用化学试剂SDS裂解细胞提取DNA，该方法比较省时，从之前的几天缩短至3h，然而提取的DNA模板产率较低，只适合短片段PCR扩增.

本研究在运用酚-氯仿抽提蛙类肌肉基因组DNA的过程中，在方法上做了部分改进，达到简化实验过程、缩短时间、提高DNA纯度的目的.具体包括：在灭菌双蒸水中将肌肉组织剪碎呈糊状，为防止残留乙醇影响蛋白酶K，频繁更换双蒸水，使脱醇时间缩短至1～2h；加大裂解缓冲液中 SDS、EDTA、Tris-HCL 的浓度，通过定时混匀加快消化速度（3～4h），提高实验效率；在沉淀过程中，加入4℃、0.1倍体积的3 mol/L的NaAc和-20℃、2.5倍体积的无水乙醇，可加速DNA析出，提高DNA浓度.改进后的整个DNA提取过程耗时10～12h，同传统的酚-氯仿抽提法相比，节省约12～24h.在两栖动物的分子系统发育研究中，是一种高效、省时、低成本的提取肌肉组织DNA的方法.

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