枸杞黄酮对H2O2致血管内皮细胞损伤的保护作用

曾泰，马磊，王伟，廖国玲

（宁夏医科大学检验学院，宁夏银川750004）

枸杞黄酮对H2O2致血管内皮细胞损伤的保护作用

曾泰，马磊，王伟，廖国玲*

（宁夏医科大学检验学院，宁夏银川750004）

研究枸杞黄酮对过氧化氢（H2O2）损伤血管内皮细胞的保护作用。以体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为实验对象，H2O2建立HUVEC的损伤模型。试验分正常对照组、过氧化氢损伤组、阳性对照组（VitC）、干预组（枸杞黄酮100、200、400 mg/L预处理）。用MTT法观察枸杞黄酮对H2O2损伤的血管内皮细胞活性的影响，测定内皮细胞中脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）的活性，分析其保护作用机制。MTT结果表明H2O2损伤后内皮细胞生长抑制率（IR）为38.8%；100、200、400 mg/L枸杞黄酮干预组IR分别为34.0%、30.7%、25.5%，IR显著降低，且与枸杞黄酮浓度呈相关（P＜0.01）；干预组中H2O2损伤内皮细胞的MDA生成减少，SOD活力增加，与枸杞黄酮浓度呈相关（P＜0.01）。枸杞黄酮的干预对H2O2所致内皮细胞的损伤有保护作用，且随枸杞黄酮浓度的增加，保护作用更强。其机制可能与枸杞黄酮抑制H2O2所致内皮细胞的脂质过氧化以及增强其抗氧化作用有关。

枸杞黄酮；血管内皮细胞；过氧化氢

血管内皮细胞的损伤和功能失调是动脉粥样硬化（AS）发生的始动环节［1］。因此，血管内皮细胞结构和功能紊乱与心血管疾病间的关系是目前国际上普遍关注的研究课题。自由基、活性氧、脂质过氧化物、H2O2等均可引起内皮细胞的损伤。抗氧化剂作为可终止自由基产生的一类化学物质，被认为在预防心脑血管疾病及癌症的发生扮演着极其重要的作用［2-3］。近年来，从天然产物中寻找抗氧化剂成为新型药物研究的重要内容，黄酮类化合物就是其中之一。鲁晓翔研究发现黄酮类化合物具有很强的抗氧化作用［4］。而宁夏枸杞是一种驰名中外的名贵中药材，黄酮类化合物是枸杞属植物中分布最广的一类化合物［5］，但是目前对其抗氧化机制尚未有过多的研究。因此，我们选择人脐静脉内皮细胞为研究对象，深入研究枸杞黄酮化合物对血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用。本试验通过对枸杞黄酮抗氧化性能的研究，以期为开发利用宁夏枸杞及其有效成分提供一定的理论参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药材与试剂

枸杞由宁夏农科院提供，其总黄酮由本研究室分离和纯化［6］。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所，MTT试剂为Sigma公司产品。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、购自南京建成生物工程研究所，其余均为国产试剂（分析纯级）。

1.1.2仪器

CO2培养箱：美国Sheldon公司产品；倒置显微镜：日本Olympus公司；酶标仪：美国Me2tertech公司。1.2方法

1.2.1提取物制备

采用80%乙醇，60℃超声提取，减压浓缩，经HPD-600型大孔树脂，乙醇洗脱，减压浓缩后，超纯水定容为枸杞黄酮类化合物溶液［7］。以芦丁为标准液绘制标准曲线，铝盐法测定总黄酮的浓度为100 mg/mL。

1.2.2细胞培养

复苏冻存的HUVEC细胞，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，于37℃饱和湿度、5%CO2培养箱中静置培养，将生长良好的HUVEC细胞用0.25%的胰蛋白酶消化1 min～2 min后，用培养基终止消化，轻轻吹打细胞壁制成细胞悬液，进行传代培养，每周传代2～3次，实验过程中采用生长汇合成单层的内皮细胞。

1.2.3试验分组

正常对照组：只加相应体积培养液；H2O2损伤模型组：在培养液中加入1 000 μmol/L H2O2诱导损伤4h；枸杞黄酮干预组：预先在培养液中分别加入终浓度为100、200、400 mg/L枸杞黄酮溶液孵育24 h，再加入1 000 μmol/LH2O2诱导损伤4 h；阳性对照组（VitC）：在培养液中先加入终浓度为20 mg/L的VitC孵育24 h，再加入1 000 μmol/L H2O2诱导损伤4 h。

1.2.4MTT法检测HUVEC活力

试验结果以MTT的OD值计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=（对照组OD-实验组OD）/对照组OD×100%。

1.2.5细胞培养液中MDA和SOD的测定

按试验分组所述方法处理后，收集细胞培养上清液，严格按MDA、SOD测定试剂盒说明书上所述的方法，分别检测MDA的含量和SOD的活性，试验重复3次，每次4个复孔，取均值。

1.2.6统计学处理

2结果与讨论

2.1枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞活力的影响

H2O2处理HUVEC后其细胞活力较正常组HUVEC细胞活力下降，（P＜0.01）。与H2O2组比较，枸杞黄酮各浓度组可抑制过氧化氢损伤引起的细胞活性降低，并随浓度增加，抑制作用增强，有显著性差异（P＜0.01）。见表1。

表1　枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞活力的影响（±s，n=4）Table 1The effects of medlar flavone on HUVEC vitality induced by H2O2

表1　枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞活力的影响（±s，n=4）Table 1The effects of medlar flavone on HUVEC vitality induced by H2O2

注：☆为H2O2组与正常组比较P＜0.01，△为与H2O2组比较P＜0.01。

组别剂量OD值IR/%正常组00.463±0.003△0.0 H2O2组1 000（μmol/L）0.283±0.002☆38.8 VitC组20（mg/L）0.356±0.002△23.1 H2O2+枸杞黄酮干预组1100（mg/L）0.306±0.002△34.0 H2O2+枸杞黄酮干预组2200（mg/L）0.321±0.002△30.7 H2O2+枸杞黄酮干预组3400（mg/L）0.345±0.002△25.5

2.2枸杞黄酮对H2O2损伤HUVEC的SOD活性和MDA含量的影响

与正常组比较，H2O2损伤组细胞培养液中细胞内MDA含量增高，SOD活性降低，其差异具有显著性（P＜0.01）。而枸杞黄酮各浓度干预组细胞SOD活性升高，MDA生成减少，其变化程度与枸杞黄酮浓度呈正比，与H2O2损伤组比较，有显著性差异（P＜0.01）。见表2。

表2　枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞SOD活性及MDA含量的影响（±s，n=4）Table 2The effects of medlar flavone on SON and MDA in HUVEC induced by H2O2

表2　枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞SOD活性及MDA含量的影响（±s，n=4）Table 2The effects of medlar flavone on SON and MDA in HUVEC induced by H2O2

注：a为损伤组与正常组比较P＜0.01，b为与H2O2组比较P＜0.01。

组别剂量MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）正常组00.418±0.042b18.837±0.456bH2O2组1000（μmol/L）2.216±0.062a13.323±0.320aVitC组20（mg/L）1.304±0.105b17.076±0.063bH2O2+枸杞黄酮干预组1 100（mg/L）1.796±0.155b15.084±0.569bH2O2+枸杞黄酮干预组2 200（mg/L）1.674±0.054b16.080±0.328bH2O2+枸杞黄酮干预组3 400（mg/L）1.427±0.106b16.616±0.313b

3讨论

H2O2是体内常见的一种活性氧，可促进自由基的生成，并直接作用于细胞膜脂质，造成脂质过氧化反应，导致细胞膜的损伤［8］。MTT参与活细胞的能量代谢，可被活细胞线粒体腺苷三磷酸酶分解，形成蓝紫色结晶物，而死细胞无此功能。该蓝紫色结晶物能被DMSO溶解，在570 nm处有一个较大吸收峰，在酶标仪上可测定其吸光度值，直接反映活细胞的数量和活性［9］。细胞培养液中MDA含量可以反映机体脂质过氧化的程度，并间接反映出细胞损伤的程度。SOD是机体内清除自由基的第一道防线，主要清除O2-，抑制脂质过氧化反应。SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力［10-11］。

本研究表明，H2O2诱导内皮细胞损伤，使内皮细胞的存活率明显下降，细胞生长抑制率（IR）为38.8%。预先加入不同浓度梯度（100、200、400 mg/L）的枸杞黄酮则可保护内皮细胞，降低细胞生长抑制率（IR分别为34.0%、30.7%、25.5%），呈细胞生长抑制率的下降与枸杞黄酮化合物的浓度正正比。内皮细胞在H2O2刺激下，与正常对照组相比，MDA含量明显增加，细胞SOD活性显著降低。加入100、200、400 mg/L枸杞黄酮预先干预，与H2O2组相比，MDA含量明显降低，细胞SOD活性显著升高，有统计学意义（P＜0.01）。MDA含量的降低说明枸杞黄酮可通过抑制脂质过氧化而减轻H2O2造成的细胞损伤；而枸杞黄酮可显著升高H2O2损伤的内皮细胞的SOD活性，提示枸杞黄酮通过增强细胞清除自由基的能力来保护细胞免受H2O2诱发的氧化损伤。枸杞黄酮对H2O2所致的内皮细胞的损伤有保护作用，且随着枸杞黄酮剂量的增加，保护作用效果更好。其保护作用可能机制与抑制脂质过氧化以及增强抗氧化作用有关。

［1］Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis-an update.N Eng l［J］.M ed，1986，314（8）:488-500

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［5］钱彦丛，宇文萍.枸杞子的化学成分及药理研究新进展［J］.中医药学报，2000，28（4）:33-35

［6］廖国玲，王伟.枸杞黄酮类化合物色谱分析条件优化［J］.宁夏医学杂志，2013，35（7）:614-615

［7］廖国玲，王伟.反相高效液相色谱法测定枸杞活性成分［J］.医学信息，2013，26（1）:68

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Protective Effect of Medlar Flavones on the Vascular Endothelial Cells Injuried by Hydrogen Peroxide

ZENG Tai，MA Lei，WANG Wei，LIAO Guo-ling*
（College of Inspection，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

To investigate the protective effect of medlar flavonoids on the injury of vascular endothelial cells（VEC）induced by hydrogen peroxide.The endothelial cells strain from human umbilical vein（HUVEC）was cultured and a model of VEC injured by hydrogen peroxide（H2O2）was established.This study was conducted as follows：normal control group，H2O2-injury group（1 000 μmol/L），VitC control group，medlar flavonoids protective groups（100，200，400 mg/L）.Cell viability was tested by using MTT.The levels of malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）were measured with corresponding kits.and analysis its possible mechanisms.MTT result demonstrated that the inhibition ratio of HUVEC was 38.8%under hydrogen peroxide，but the inhibition ratio of medlar flavonoids protective groups were 34.0%，30.7%，25.5%，which were lower than H2O2-injury group.Medlar flavonoids could inhibit the hydrogen peroxide induced VEC reduction，reduced inhibition ratio，the MDA production，and the activity of SOD was increased under hydrogen peroxide.And showed does-dependent manner.These results demonstrated that medlar flavonoids can protect the VECs from H2O2-induced injury，With the increase of the concentration of medlar flavone，stronger protective effect.The possible mechanism may refer to the its effect of anti-lipid peroxidation and SOD activity enhancing.

medlar flavonoids；umbilical vein endothelial cells；H2O2

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.004

2014-05-20

宁夏医科大学大学生科技创新项目（国家级和区级201210752004）

曾泰（1991—），男（汉），学士，研究生在读，研究方向：临床医学检验。

廖国玲（1967—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：西部特色天然产物和糖尿病血管病变研究。