醋酸菌分离及其有机酸产生规律

李亚武，张宝善，*，魏冉，王玮，黄雯

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062；2.西北政法大学商学院，陕西西安710122）

醋酸菌分离及其有机酸产生规律

李亚武1，张宝善1，*，魏冉1，王玮1，黄雯2

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062；2.西北政法大学商学院，陕西西安710122）

研究不同形态醋酸菌产生有机酸规律的比较。经HPLC法测定有机酸含量发现：不产膜菌S菌产生奎宁酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸的能力比产膜菌R菌高；而产生乳酸和柠檬酸的能力低于R菌。因此推断鸟氨酸循环、糖异生作用和三羧酸循环参与醋酸菌菌膜的形成。

醋酸菌；R菌；S菌；产膜

醋酸菌广泛分布于果园的土壤中、酸败食物或水果表面［1］，是一大类革兰氏阴性、严格需氧菌，属于α-变形菌门［2］。早在1868年人们就已经确定醋酸菌是传统酿造醋的主要微生物［3-4］，试验证明连续传代培养后具有高频率的突变性。有些醋酸菌（产多糖薄膜）发生变异后，会丧失分泌菌膜的能力；而有些醋酸菌（不分泌菌膜）变异后发生分泌菌膜的现象。部分研究现象表明，根据能否分泌菌膜可将醋酸菌分成两类：一类不产膜且菌落表面光滑，标记为S菌；另一类能具有分泌菌膜的能力而菌落表面粗糙，记为R菌［5］。

醋酸菌多糖薄膜一般悬浮于发酵液表层，作为提供菌体与氧气接触的空间载体［6］。S菌好生长于液态深层通气培养液中［7］，不分泌多糖薄膜，只分泌少量的胞外多糖。由于培养液中缺乏多糖薄膜，供氧状态低于菌体生长代谢所需水平，故S菌较为适合用于搅拌、振荡或额外通氧等工艺发酵高酸度醋品过程。R菌具有分泌多糖薄膜的能力［8］，因此在静态培养中，R菌株通过在培养基表面产生薄膜以维持高度的供氧状态，其更适合用于表面静态发酵培养和浅层振荡培养。研究表明，菌体多糖薄膜在发酵工艺中具有存在的必要性，可为菌体细胞筛选出较为适合的外环境，抵御外环境内的有害物质［9］。

通过对醋酸菌分泌多糖薄膜的过程进行研究分析［10-15］，认为柠檬酸循环、磷酸戊糖循环和糖异生作用可能参与菌体多糖薄膜生成过程，代谢中间产物多为有机酸，经菌体细胞作用释放到培养液中。选择以上代谢作用多种中间代谢产物进行测定，研究其变化规律，推定出参与菌体多糖薄膜分泌的代谢途径。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌种

醋化醋杆菌（Acetobacteraceti，A.aceti）：醋酸菌属，保藏于陕西师范大学食品工程与营养科学学院食品发酵试验室。

1.1.2试验原料

1.1.2.1浓缩苹果汁

陕西师范大学食品工程与营养科学学院中试车间出产。

1.1.2.2培养基

土豆葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar medium，PDA）：1 L蒸馏水、200 g土豆、15 g琼脂、20 g葡萄糖、pH自然。115℃灭菌20 min备用。醋酸菌分离培养基（Yeast Peptone Dextrose Glycerine，YPDG）：1 L蒸馏水、5 g甘油、4%（体积分数）95%乙醇、5 g胰蛋白胨、5 g葡萄糖、5 g酵母膏、20 g琼脂，pH自然。115℃灭菌20 min备用。

1.1.3主要试剂与仪器

有机酸标品（乳酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、奎宁酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、乙酸和草酸）均购自于Sigma公司；甲醇（色谱纯），抗坏血酸、磷酸二氢钾（分析纯）；高效液相色谱（Thermo公司Ultimate 3 000型）。

1.2试验方法

1.2.1菌种分离与鉴定

分离鉴定试验流程：

试验室保藏醋化醋杆菌（A菌）经PDA培养基中活化后接种于YPDG培养基，画线分离出具有白色透明圈的单菌落，进行纯化培养，每天观察并记录菌落形态。对不同形态的单个菌株依照伯杰氏手册分别进行醋酸菌鉴定［16］（革兰氏染色鉴定试验，产酸鉴定试验，运动性鉴定试验，醋酸菌生理生化性质鉴定试验）。

1.2.2HPLC法测定有机酸

1.2.2.1色谱条件

DiamonsilC18柱，柱温25℃，柱子250 mm×4.6 mm，紫外检测波长210 nm。

1.2.2.2流动相的配置

混合标品Ⅰ（7个有机酸混合标样）：流动相A，0.01 mol/L磷酸二氢钾∶甲醇=93∶7（体积分数），用磷酸调节pH为2.2。流动相B，甲醇。流速0.7 mL/min。

混合标品Ⅱ（4个有机酸混合标样）：流动相A，0.01 mol/L磷酸二氢钾∶甲醇=93∶7（体积分数），用磷酸调节pH为2.0。流速0.6 mL/min。

注：磷酸盐溶液对C18柱具有损害作用，因此在使用时需与甲醇混合配置。流动相在使用前均用0.45 μm多孔滤膜真空抽滤处理，以防不溶物阻塞C18柱。标品成分及含量如表1所示。

表1　有机酸混标种类及含量Table 1Organic acid mix type and content

以0.5%接种量（质量分数）接入酵母菌活化液于灭菌苹果汁中进行酒精发酵，在30℃下发酵6 d，直至酒精度达到6%（体积分数），酒精发酵结束。按照10%（体积分数）接种量接入醋酸菌培养液于发酵醪液中进行醋酸发酵，在30℃下R菌恒温静态发酵15d；S菌以180 r/min转速振荡发酵15 d；同时分别在平行条件下选择A菌作为对照。每隔3天取1 mL发酵液，稀释3倍后经0.22 μm孔径有机膜过滤后HPLC法检测有机酸含量。

2结果与讨论

2.1醋化醋杆菌不同形态分离鉴定

试验室保藏醋化醋杆菌经PDA培养基中活化后接种于YPDG培养基，画线分离出具有白色透明圈的单菌落，进行纯化培养并每天记录菌落形态，观察单个菌落的形态稳定性。30 d后，传代培养的醋酸菌菌落形态趋于稳定。其菌落形态如图1所示。

图1　醋酸菌不同菌落形态Fig.1Different forms of A.acet

图1（a）中醋酸菌光滑型菌落相互分离，菌体白色，菌落直径较小，表面光滑，无明显凸起，呈薄层状。图1（b）中醋酸菌粗糙型菌落聚集，相互融合，菌体白色，生长迅速，菌落直径大，表面粗糙，呈煎蛋型。两种形态的菌经伯杰氏手册醋酸菌鉴定方法鉴定均为醋化醋杆菌，根据其菌落形态不同，分别标记为S菌（光滑）和R菌（粗糙）。

2.2S菌和R菌有机酸产生规律的比较

有机酸混合标品Ⅰ的分离结果见图2。

图2　有机酸混合标品Ⅰ分离图谱Fig.2Organic acids mixedⅠseparation maps

图2表明，奎宁酸最早被分离出来，其保留时间与水峰较为接近为4.007 min，其余根据保留时间先后依次是苹果酸（4.710 min）、丙二酸（5.343 min）、乳酸（5.733 min）、柠檬酸（7.097 min）、富马酸（8.170 min）、琥珀酸（9.407 min）。

有机酸混合标品Ⅱ的分离结果见图3。

由图3可知，草酸的吸收峰值较高，出峰时间最早，其保留时间为4.237 min，其次依次为酒石酸（4.770 min）、VC（5.250 min）、乙酸（7.423 min）。

图3　有机酸混合标品Ⅱ分离图谱Fig.3Organic acids mixedⅡseparation maps

表2　不同有机酸的标准曲线Table 2The standard curve of mixed organic acids

将有机酸混合标品配制成不同的梯度，在相应色谱条件下，分别以不同浓度的进样，求得各成分质量浓度y（mg/L）对峰面积x的线性回归方程；通过线性分析可得各成分的标准曲线，如表2所示，其中，R2值均在0.99以上，证明x与y线性相关，拟合置信度高。

通过HPLC法测定随醋酸发酵时间S菌、R菌和A菌在静置或振荡条件下的各种有机酸，所得峰面积经加标回收减少误差后，带入表2中公式计算可得各有机酸含量，如表3所示。

表3　不同醋酸菌有机酸的产生状况Table 3Organic acids content in different acetic acid bacteria g/L

续表3不同醋酸菌有机酸的产生状况Continue table 3Organic acids content in different acetic acid bacteria g/L

通过分析数据可知，在测定的11种有机酸中，除草酸与丙二酸未检出，其余九种有机酸均有检出，变化趋势各有特点。酒石酸的含量在不同条件下均呈现逐渐下降趋势，且振荡培养酒石酸含量高于静态培养，认为是由于在发酵过程中尤其是静置时酒石酸容易与金属离子发生螯合反应形成沉淀；VC在发酵过程中变化微弱，易被氧化因此含量较低；乙酸是醋酸菌代谢主要产物，随发酵进行含量逐渐升高，但振荡培养下乙酸的含量较静态培养下的含量略低，与S菌和部分A菌在振荡培养下具有乙酸过氧化的作用有关；奎宁酸的含量组内较为稳定，但S菌发酵组含量明显高于其它组，由于其代谢机制尚不明了，根据其合成机制推测奎宁酸经代谢可进入鸟氨酸循环，导致R菌组和A菌组奎宁酸的含量降低，表明鸟氨酸循环参与多糖薄膜的产生；苹果酸的含量随发酵时间增大逐渐降低，最终积累量R菌组低于A菌组及S菌组，认为是TCA循环参与醋酸菌产生薄膜过程，苹果酸被大量转化为草酰乙酸；乳酸含量逐渐降低，醋酸菌可通过糖异生作用将乳酸转化为乙酸，同时S菌和部分A菌在振荡培养下具有过氧化的作用，可将乳酸通过TCA循环代谢为二氧化碳和水，导致在振荡组乳酸的含量低于静置组；随着发酵时间的增长，柠檬酸含量增多，静置组高于振荡组，分析认为在静态培养条件下，TCA循环参与醋酸菌分泌多糖薄膜作用；富马酸随发酵时间增加其含量逐渐降低，R菌组明显低于其他组，由于在TCA循环中，富马酸被转化为苹果酸，琥珀酸变化规律与富马酸相仿，可显示出TCA循环参与菌体分泌多糖薄膜。

3试验结论

3.1有机酸变化规律

1）草酸和丙二酸并未检测出；

2）VC在发酵过程中不随着发酵时间的变化而变化且含量较低；

3）在发酵过程中，奎宁酸的含量较为稳定，S菌发酵组积累量具有明显优势；

4）酒石酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸含量随发酵进行逐渐降低，振荡组明显优于静置组；

5）随发酵时间增长，乳酸含量降低，静置组高于振荡组；

6）乙酸和柠檬酸含量随发酵时间增大而增高，静置培养下积累量高于振荡条件。

3.2产膜过程代谢机制的探究

通过对不同产膜能力菌株发酵过程中多种代谢机制中间产物的含量测定，对比组间有机酸变化规律，认为在醋酸菌分泌多糖薄膜的过程，TCA循环、糖异生作用和鸟氨酸循环等细胞代谢机制均以不同形式参与其中。由于部分有机酸代谢机制不明确，因此只能从其含量变化规律进行推定，但菌体分泌多糖薄膜过程受多种因素交互影响，但具体机制有待进一步研究。

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Separation of Acetobacter aceti and Compared the Rules of Produced Organic Acid

LI Ya-wu1，ZHANG Bao-shan1，*，WEI Ran1，WANG Wei1，HUANG Wen2
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China；2.Business School，NorthWest University of Politics&Law，Xi'an 710122，Shaanxi，China）

For compared the rules of different forms of Acetobacter aceti produced organic acid.Determination of organic acids by HPLC method found：S strain had more ability than R strain for produced quinic acid，malic acid，fumaric acid and succinic acid and less ability for produced ability lactic acid and citric acid.Therefore，we can infer that ornithine cycle，gluconeogenesis，and the citric acid cycle involved in the formation of Acetobacter aceti pellice.

Acetobacter；R strain；S strain；pellicle-forming

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.007

2014-03-26

西安市科技计划项目（SF1234-2）

李亚武（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。