右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达的影响*

2015-10-31 01:12西安市第四医院麻醉科西安710004雷安锋彭春晓王秋月
陕西医学杂志 2015年9期
关键词:咪啶肾小管咪定

西安市第四医院麻醉科 (西安 710004) 雷安锋 段 晶 陈 燕 彭春晓 王秋月



右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达的影响*

西安市第四医院麻醉科 (西安 710004)雷安锋段晶陈燕彭春晓王秋月▲

目的:观察右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达影响,探讨其可能机制。方法: 将大鼠肾小管上皮细胞复苏后培养,加入10ng/ml脂多糖(LPS),均经培养后分为3组,A组为空白对照组,B组为对照组,加入右美托咪定2.5μg,C组为实验组,先加入阿替美唑10μg后30min加入右美托咪定2.5μg,培养12h,免疫组化法检测TLR4蛋白表达及TLR4mRNA水平,并测定细胞凋亡率。结果:B组应用右美托咪定后,TLR4水平为(45.1±13.5)×103均低于A组、B组(tBA=6.549,tBC=5.660,P<0.05);B组TLR4mRNA相对表达值为0.46±0.02,均低于A组、C组(tBA=27.599,tBC=24.749,P<0.05)。B组使用右美托咪定后,细胞凋亡率为(34.6±7.6)%,均明显低于A组、C组(P<0.05)。结论:右美托咪啶可下调脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达,且右美托咪啶对TLR4的调节与α2AR被激动相关。

KEY WORDSKidney diseases/chemicalinducedLipopolysaccharidesDexmedetomidine/therapeutic useEpithelial cells/metabolismAnimals,laboratoryRats@TLR4

资料与方法

1主要试剂大鼠肾小管上皮细胞(XX细胞库);脂多糖(LPS 批号:L2880,天津灏洋生物制品有限公司);右美托咪定(批号:09081232江苏恒瑞医药股份有限公司);ELISA试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司);PTPCR试剂(大连宝生物工程有限公司);引物合成(伤害生工生物工程技术服务有限公司);PCR扩增仪(美国PE公司)

2研究方法复苏细胞后,接种于50ml玻璃瓶中,于MEM培养基中行常规培养,MEM培养基含10%胎牛血清、100U/ml青霉+100U/ ml链霉素等,置入37°C、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱,并于每1~2h更换培养基;待细胞长成致密单层后,使用0.25%胰蛋白酶消化,按1×105浓度接种于24孔板中,使细胞贴壁生长18~24h。然后加入LPS(10ng/ml)培养12h。然后随机分为3组,每组10个。

2.1处理方法:A组空白对照组。B组对照组,加入右美托咪定2.5μg,C组实验组,先加入阿替美唑10μg后30min加入右美托咪定2.5μg。3组均继续培养12h。

2.2TLR4水平及TLR4mRNA水平测定 :①采取免疫组化方式测定肾脏组织TLR4水平。②测定TLR4mRNA水平:严格按照试剂说明进行,TLR4上游引物:5’-GTCCATCGGTTGATCTTGGGA-3’,下游引物为:5’-AGAATTGCCAGCCATTTTTAA-3’,扩增片段长度为681bp。β-action为内参,其上游引物为:5’-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3’,下游引物为:5’-AGAGGTCTTTACGGATGTCAAACC-3’,扩增片段长度为281bp。PCR反应体系反应条件:94℃环境下变性5min,然后按照94℃30s、51℃40s、72℃60s,行扩增30个循环,最后于72℃下延伸5min。最后取各组样本产物5μl,与溴酚蓝载样缓冲液1μl一起加入1.5%琼脂糖凝聚样品孔中,70V恒压电泳20min,使用DH2000凝胶图像分析系统进行分析,TLR4mRNA灰度值与β-action灰度值比值作为TLR4mRNA表达水平。

2.3细胞凋亡检测:使用PBS洗涤细胞,吸取含细胞平衡液100μl至离心管,加入5μl Annexin V-FITC及5μl PI,避光室温反应15min,加入400μl平衡液于流式细胞仪上检测。

3观察指标①肾脏组织TLR4水平差异;②TLR4mRNA水平;③细胞凋亡率。

结 果

1三组大鼠肾脏组织TLR4水平及TLR4mRNA水平比较见表1。B组应用右美托咪定后,TLR4水平及TLR4mRNA为(45.1±13.5)×103、(0.46±0.02)均低于A组、C组(P<0.05)。

2三组大鼠肾脏组织细胞凋亡率比较见表2。

表1  三组大鼠肾脏组织TLR4RTLR4 mRNA水平比较

表2  三组大鼠肾脏组织细胞凋亡率比较(%)

B组使用右美托咪定后,细胞凋亡率为(34.6±7.6)%,均明显低于A组、C组(P<0.05)。

讨 论

研究[1]表明:急性肾损伤(AKI)为脓毒血症并发症之一,是各种原因所致机体肾功能在几小时至几天内突然下降的综合征。研究[2]表明:约50%脓毒症患者发生AKI,死亡率高达60%。

右美托咪啶(Dexmedetomidine,Dex)为新型高选择性α肾上腺素能受体(α2adrenogic recptor,α2AR)激动剂,其机制为通过激动中枢神经系统α2A最密集的区域-脑干蓝斑引发并维持自然非动眼睡眠状态,产生镇静、催眠作用。Dex还具有镇痛、稳定血流动力学和利尿的效应,可用于ICU患者的镇痛,而且有研究[3]表明:Dex对脓毒症大鼠的肾功能具有一定的保护作用,减少肾衰竭的发生。动物实验[4]表明:脓毒症大鼠体内LPS与肾脏TLR4结合,激活TLR4信号传导通路,导致IκB从IκB/ NF-κB复合物释放,NF-κB活化转位进核,使信号下游致炎因子TNF-α,IL-1B和IL-6增多导致急性肾损伤。Dex降低脓毒症大鼠血清TNF-α,IL-1B和IL-6。所以防治脓毒症导致的急性肾损伤可以通过下调TLR4的表达或抑制TLR4信号通路控制炎性反应对肾脏损伤。而Dex可降低脓毒症大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达,达到肾脏保护作用。本研究结果表明:肾小管上皮细胞TLR4表达水平明显低于A组,可见右美托咪定可下调肾小管上皮细胞TLR4表达,保护肾脏;而C组应用α2AR受体阻滞剂再应用右美托咪定,结果发现改组TLR4表达、TLR4mRNA及细胞凋亡均低于B组,可见右美托咪定下调TLR4表达发挥肾脏保护作用与α2AR受体激动有关。

[1]蔡玥娇,刘华跃,钟丽敏.右美托咪定对脓毒症大鼠脑组织炎性反应的影响[J].中华麻醉学杂志,2013,33(6):749-751.

[2]何许伟,邱泽亮,楼天正.间歇性高容量血液滤过对严重脓毒症患者Toll样受体4的影响[J].中国医师杂志,2013,7(1):58-60.

[3]Kumpf O,Giamarellos-Bourboulis EJ,Koch A,etal. Influenceof genetic variations in TLR4 and TIRAP/Mal on the course ofsepsis and pneumonia and cytokine release:an observationalstudy in three cohorts[J].Crit Care,2010,14(3):103-113.

[4]付朝晖,姚尚龙,袁世荧.盐酸戊乙奎醚对脓毒症致大鼠急性肺损伤时Toll样受体4及NF-κB表达的影响[J].中华麻醉学杂志,2013,33(9):1134-1137.

(收稿:2015-03-20)

The influence of Toll receptor 4 in renal tubular epithelial cells of dexmedetomidine on rat injured by lipopolysaccharide

Department of Anesthesiology,The 4th Xi’an Hospital(Xi’an 710004)

Lei AnfengDuan JingChen Yanet al

Objective: To observe the effect of dexmedetomidine for Toll receptor 4 in renal tubular epithelial cells on rat injured by lipopolysaccharide,and explore the possible mechanism.Methods:Rat renal tubular epithelial cells and recovery, training,then they were added 10 ng/ml lipopolysaccharide(LPS)to culture and divided into A group(blank control group), group B(control group) was added 2.5 μg dexmedetomidine, group C (experimental group)was joined the 10μg atipamezole,2.5 μg dexmedetomidine after 30min, developing 12h,then took immunohistochemistry to measure expression of TLR4protein and TLR4mRNA, and determine the apoptosis rate of them. Results:Toll receptor 4 level was (45.1 ± 13.5) × 103in group B adopted dexmedetomidine and was lower than those of A and B group,(tBA=6.549,tBC=5.660,P<0.05),B group’ TLR4mRNA was (0.46 ± 0.02)and lower than those of A and C group,(tBA=27.599,tBC=24.749,P<0.05).The apoptosis rate of group B was (34.6±7.6)% and significantly lower than that in A and C group(P<0.05).Conclusion: Dexmedetomidine can down Toll receptor 4 expression in renal tubular epithelial cells of rat injured by lipopolysaccharide, and the regulation for TLR4 of dexmedetomidine is related with α 2AR excited.

中国医科大学附属第一医院内分泌科

R631.2

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.003

﹡辽宁省科技攻关计划项目(2011225017)

主题词肾疾病/化学诱导脂多糖类右美托咪啶/治疗应用上皮细胞/代谢动物,实验大鼠@TLR4

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