凝集素PSL通过下调HK2抑制前列腺癌细胞Warburg效应的研究*

西安市儿童医院儿科疾病研究所(西安 710002)　吴守振　武海滨　刘　萍

张　红▲



西安市儿童医院儿科疾病研究所(西安 710002)吴守振武海滨刘萍△

张红▲

目的：研究凝集素PSL对前列腺癌Warburg效应的影响。方法：采用色谱分离纯化凝集素PSL，HPLC分析其纯度。Real-time PCR 检测己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶2(PKM2)和磷酸果糖激酶(PFK)的表达。MTT方法检测细胞活力。结果：色谱分离纯化获得了纯度大于95%的PSL；PSL抑制了前列腺癌细胞PC3的细胞活力，降低了HK2的表达，抑制了PC3细胞的葡萄糖吸收和乳酸生成。结论：PSL通过下调前列腺癌细胞PC3细胞HK2的表达抑制其Warburg效应，进而抑制了PC3细胞活力。

代谢异常是肿瘤的重要特征之一，肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下也通过糖酵解方式获得能量，而不是通过三羧酸循环和氧化磷酸化。这种现象是细胞恶变过程中最为基础的代谢改变之一，被称为“Warburg效应”或者有氧糖酵解[1]。已糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)是糖酵解过程中3个极为重要的限速酶。

植物凝集素是一类糖结合特异性非免疫原性蛋白质或糖蛋白，广泛存在于多种植物中。凝集素对多种细胞系具有凝血活性，毒性作用，抗增殖活性，抗肿瘤，免疫激活及抗真菌和抗病毒等多种生物学活性。研究表明：从刀豆种子中提取的一种新型凝集素---伴刀豆球蛋白A (ConA)，具有潜在的抗肝癌作用[2]。骆驼蓬凝集素对人类宫颈癌细胞(HeLa)，人类食管癌细胞(Eca-109) 和人类肝癌细胞( BEL-7404)等三种细胞系均具有抑制增殖的活性。其中，对人类宫颈癌细胞的抗增殖活性比较显著，并可以诱导凋亡的发生[3]。

材料与方法

1 研究材料

1.1细胞： 前列腺癌细胞PC3购自上海细胞所。培养条件为37℃，5%CO2，培养基为含10%的DMEM培养基。

1.2主要试剂及仪器： 抗人HK2、PFK和PKM2单克隆抗体购自美国CST公司，转染试剂X-treme GENE购自Roche公司，Real time PCR相关试剂及引物购自Takara公司。色谱仪为美国GE公司，HPLC仪器为美国Waters公司，Real time PCR仪为美国Life公司。

2 研究方法

2.1PSL的提取、纯化： 从新鲜Polygonatum sibiricum Red中采用PBS低温提取，硫酸铵分级沉淀粗提取，然后以阳离子交换(流动相为Tris-Cl，pH 7.0，线性洗脱)和分子筛层析(流动相为PBS，pH 7.2)进行纯化。所得PSL进行HPLC鉴定其纯度，流动相为PBS，pH 7.2。

2.2siRNA 干涉： 将前列腺癌细胞PC3接种至6孔板，待细胞密度达到80%～90%时准备转染。转染方法按X-tremeGENE说明书进行。HK2干涉片段和对照购自上海吉玛公司。

2.3 细胞活力： 以3000个/孔将PC3细胞接种入细胞板，设3个复孔，以20 μg/ml PSL处理细胞，分别在24 h，48 h，72 h和96 h检测。检测时，在每孔细胞中加入100μl新鲜培养基。并将培养基另外加入4个孔，作为调零孔。加入10 μl MTT试剂，尽量保证加入均匀，无气泡产生。放入细胞培养箱37℃，5%CO2孵育1 h。4 h后，加DMSO，溶解10 min。将96孔板放入96孔微板酶标仪读数，参数设定：吸收波长440 nm，参考波长660 nm。实验重复3次。

2.4葡萄糖消耗： 1×105个/孔PC3细胞接种到6孔板，加入20 μg/ml PSL处理24 h，将细胞培养液补足体积至2 ml，置于培养箱中进行48 h培养，条件为37℃、5%CO2。将培养液收集到1.5 ml EP管中，以初始细胞培养液葡萄糖量作为空白。按1∶200比例配制反应液，并设置空白和标准对照。将反应液混匀后在37℃水浴准确反应15 min，以酶标仪测定吸光度值。实验重复3次。

2.5乳酸生成： 1×105个/孔PC3细胞接种到6孔培养板，加入20 μg/ml PSL处理24 h，将细胞培养液补足体积至2 ml，置于培养箱中进行48 h培养，条件为37℃、5%CO2。将培养液收集到1.5 ml EP管中，以初始细胞培养液乳酸量作为空白。按样本 0.02 ml，酶工作液 1 ml，显色液 0.2 ml比例配制反应液，并设置空白和标准对照。将反应液混匀后在37℃水浴反应10 min后，加入终止液2 ml，按100 μl/孔加入96孔板，以酶标仪测定吸光度值。实验重复3次。

2.6 Western blot： 收集各种处理的细胞，用含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，充分裂解。BCA法进行蛋白定量，取60 μg 处理好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析，120V恒压转移2 h，2% BSA室温封闭30 min，将NC膜与待检测的一抗室温孵育1 h；PBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗，室温孵育30 min。用ECL发光试剂盒处理NC膜，发光显影。

2.7Real time PCR： 从处理的PC3细胞中提取RNA，定量后，取2 μg总RNA进行反转录制备cDNA。以cDNA为模板进行Real time PCR，反应混合液为44 μl、Tag聚合酶1 μl，反应终体积为50 μl。扩增条件为：95℃预变性2 min，然后93℃ 40 S，60℃ 35s，72℃ 30s共40个循环。以β-actin进行量化。设置3个复孔，实验重复3次。

结　果

1 PSL的提取、纯化和鉴定从Polygonatum sibiricum Red我们粗提了PSL，经过阳离子交换(见附图A)和分子筛层析(见附图B)两步层析方法进一步纯化，SDS-PAGE初步鉴定(见附图C)，Western blot 结果表明纯化的PSL能够与其抗体特异性结合(见附图D)，HPLC检测纯化的PSL的纯度为97%(见附图E)。

附图PSL纯化鉴定结果[A:阳离子层析结果(箭头为PSL峰)；B:分子筛层析结果(箭头为PSL峰)；C:SDS-PAGE结果(箭头为PSL)；D:免疫印迹分析结果；E:HPLC分析结果]

2 PSL抑制了前列腺癌细胞PC3的Warburg效应我们分析了PSL对前列腺癌细胞的代谢影响，结果表明PSL明显抑制了PC3细胞的葡萄糖吸收减少了1.76±0.18倍。PSL降低了PC3细胞降低2.43±0.25倍乳糖生成，提示PSL抑制了前列腺癌细胞的Warburg效应。

3PSL下调前列腺癌细胞PC3的HK2表达我们观察了PSL对Warburg效应三个关键的限速酶表达的影响，Western blot和Real-time PCR结果表明PSL提高了PC3细胞中HK2的表达，而对PFK和PKM2的表达没有影响(P>0.05)。

4 PSL抑制了前列腺癌细胞PC3的细胞活力 我们检测了PSL对前列腺癌细胞活力的影响，PSL降低了PC3细胞活力。以siRNA抑制HK2的表达时，PSL对PC3细胞活力的抑制无影响(P>0.05)。

讨　论

Polygonatum sibiricum Red和Polygonatum cyrtonema Hua为同科不同种植物。研究表明：Polygonatum cyrtonema Hua凝集素(PCL)对多种癌细胞具有显著的抗增殖和凋亡诱导活性。PCL能诱导鼠纤维肉瘤L929 细胞凋亡，其糖结合特异性和凋亡诱导活性之间存在一种紧密的关系，这种凝集素诱导的凋亡机制与半胱天冬酶(Caspase)依赖途径[4]和抑制 Ras/Raf 自救或抗凋亡途径相关[5]。但是，Polygonatum sibiricum Red凝集素在肿瘤中的作用和机制还尚不清楚。

本研究对PSL前列腺癌细胞的增殖及代谢中的作用作了研究，初步探讨了其机制。我们首先提取制备了PSL，从Polygonatum sibiricum Red中，采用硫酸铵分级沉淀粗提了PSL，进一步利用两步层析(阳离子层析和分子筛层析)，我们制备了纯度大于95%的PSL，制备的PSL能够与其抗体特异性结合。本研究我们制备的PSL纯度较高，制备方法简单。

Warburg效应是肿瘤代谢异常的主要表现形式，为肿瘤的生长提供能量、代谢物质，促进肿瘤的发生发展。其中，葡萄糖的极大吸收和乳酸生成是肿瘤Warburg效应的重要特征[6]。前列腺癌是男性生殖泌尿系统常见的恶性肿瘤之一[7]，随着我国人口老龄化和生活方式的改变，前列腺癌发病率明显增高。更为重要的是，大部分前列腺癌患者发现时已为晚期[8]。本研究中，我们观察了PSL对前列腺癌代谢的影响。我们的研究结果显示PSL能够明显抑制PC3细胞的葡萄糖吸收和乳酸生成，提示PSL改变了前列腺癌的代谢异常。进一步，我们检测了PSL对前列腺癌细胞活力的影响，正如我们预期的，PSL明显抑制了前列腺癌的细胞活力，抑制了其生长，这些研究结果表明：PSL通过抑制前列腺癌Warburg效应而抑制肿瘤生长，为PSL在肿瘤中的作用提高依据。

已糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PKM)是糖酵解过程中3个极为重要的限速酶。其中，HK2是肿瘤Warburg效应中的第一个限速酶，是肿瘤治疗的一个潜在靶点[9]。HK2在许多肿瘤组织中表达的量及活性增加明显增高，当病灶发生转移时，表达更高[10]，HK2在前列腺癌组织中表达水平明显高于良性前列腺增生及正常前列腺组织[11]。本研究中，我们检测了PSL对Warburg效应3个限速酶的影响。我们发现：PSL抑制了前列腺癌PC3细胞HK2的表达，而对PFK和PKM2的表达没用影响，表明PSL是通过下调HK2的表达抑制了前列腺癌细胞的Warburg效应。细胞活力实验进一步证实了我们的实验结果。当以siRNA干涉HK2的表达时，PSL对前列腺癌细胞活力的抑制能力消失。

总之，通过本研究，我们制备了纯度较高的PSL，观察了其对前列腺癌Warburg效应的影响，发现PSL能够通过下调HK2的表达抑制前列腺癌细胞的Warburg效应，进而抑制前列腺癌细胞活力，提示PSL可能是前列腺癌较好的一个治疗药物。

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[5] Liu B, Wu JM, Li J,etal．Polygonatum cyrtonema lectin induces murine fibrosarcoma L929 cell apoptosis and autophagy via blocking Ras-Raf and PI3K-Akt signaling pathways[J]. Biochimie, 2010,92(12) : 1934-1938.

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(收稿：2015-04-30)

陕西省中医药研究院

R737.25

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.007

* 陕西省科技厅社会发展攻关项目(S2012ZY241)

△ 陕西中医药大学

主题词 前列腺肿瘤/药理学前列腺肿瘤/血液