水产品中霍乱弧菌可视化环介导等温扩增检测方法的建立及应用

胡兴娟 沈飚 周秀锦 邵宏宏 张静 朱应伟

（舟山出入境检验检疫局 浙江舟山 316000）

水产品中霍乱弧菌可视化环介导等温扩增检测方法的建立及应用

胡兴娟 沈飚 周秀锦 邵宏宏 张静 朱应伟

（舟山出入境检验检疫局 浙江舟山 316000）

利用环介导等温扩增技术建立一种快速检测水产品中霍乱弧菌的方法。针对霍乱弧菌ctxA基因的保守区域设计特异性引物，利用钙黄绿素建立可视化环介导等温扩增检测体系，研究其特异性与灵敏性。结果表明，含ctxA基因的霍乱弧菌可得到特异性扩增，而其他与霍乱弧菌（含ctxA基因）共存于海产品中的7种细菌均未得到扩增，DNA检测下限为81 fg/μL。用建立的环介导等温扩增方法对150份水产品进行检测，检出2份阳性样本，与PCR结果一致。该方法对实验仪器和操作人员的要求低，具有良好的实用性，可用于水产品中霍乱弧菌的检测。

霍乱弧菌；环介导等温扩增法（LAMP）；可视化；ctxA；检测

1 前言

霍乱弧菌（vibrio cholera，vc）是一类重要的食源性致病菌，能引起急性肠道传染病，在全球爆发了多次大规模的疫情，直接危害人类的健康。霍乱弧菌检测已成为食品安全的重要指标，目前国内外霍乱弧菌的检测方法有：经典的培养生化鉴定法、PCR-凝胶电泳法、实时荧光PCR法、基因指纹图谱分析法等［1］。尽管检测方法有很多，但各种方法都存在其自身的优势和局限性。因此，开发一种简便、特异、灵敏度好、价廉，适用于基层推广的检测方法，对霍乱弧菌的监控将起到积极作用。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是近年来发展出的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。目前，该技术在食源性致病菌的检测中已有研究应用报道［2］。但大多数的研究者依然采用电泳法对反应产物进行检测［3］，或采用核酸染料SYBR Green进行显色［4］，都需开盖检测，这就不可避免的造成气溶胶污染。钙黄绿素（Calcein）是一种荧光螯合剂，Tomita等［5］将该试剂作为反应指示剂首次应用于LAMP技术，该方法不需后续的电泳或显色，反应结束后就可直接通过反应产物的颜色变化判断检测结果，操作更简单，结果更可靠，有效避免了产物污染及假阳性问题。

为此，本研究针对霍乱弧菌ctxA基因设计LAMP引物，利用钙黄绿素的荧光显色指示剂作用，建立了可视化的霍乱弧菌LAMP检测体系。为快速检测霍乱弧菌，有效预防及控制霍乱弧菌感染奠定基础。

2 材料和方法

2.1材料

2.1.1菌株

大肠杆菌（E.coli，ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、副溶血弧菌（V.Parahaemolyticus，ATCC 17802）：购自广东环凯微生物研究所；非O1/O139霍乱弧菌分离株H4-3（V.choerae non-O1/O139，H4-3）、溶藻弧菌分离株（V.alginolyticus，V.alg）、拟态弧菌分离株（V.minicus，V.m）、创伤弧菌分离株（Vibrio vulnificus，V.v）：均由舟山出入境检验检疫局水产品实验室保存。

2.1.2试剂

营养琼脂、缓冲蛋白胨水（BPW）、碱性蛋白胨水（APW）：购自北京陆桥技术有限责任公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒：购自invitrogen公司；DNA标准DL2000：宝生物工程（大连）有限公司产品；10× Thermopol reaction buffer、Bst DNA polymerase 8U：购自New England Biolab；甜菜碱（Betaine）、氯化锰：购自sigma公司；dNTPs：购自TaKaRa公司；琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（EB）染料：购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

2.1.3主要仪器

NanoDrop ND-100分光光度计：美国NanoDrop科技公司；恒温震荡金属浴：杭州博日科技有限公司；PCR扩增仪：美国ABI公司；凝胶成像系统：美国GE公司；电泳仪：Bio-Rad公司。

2.2方法

2.2.1细菌基因组DNA的提取

将供试菌株于增菌培养基（弧菌以碱性蛋白胨水培养，其他菌株以缓冲蛋白胨水培养）中培养，按照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，建立参考菌株DNA模板库，保存于-20℃备用。

2.2.2引物的设计与合成

针对霍乱弧菌ctxA基因，设计特异性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1　扩增ctxA基因的LAMP引物序列

2.2.3LAMP反应体系

LAMP扩增反应总体积为25 μL：内引物（FIP和BIP）各1.6 μmol/L，外引物（F3和B3）各0.2 μmol/L，1×Thermopolreaction buffer的成分为20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8），10 mmol/L KCl2，10 mmol/L（NH4）2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1%Triton X-100；Bst DNA polymerase 8U；4 mmol/L的MgCl2；0.8 mol/L的Betaine；1.4 mmol/L的dNTPs；0.5 mmol/LMnCl2；0.05 mmol/L Calcein；Template DNA2 μL，其余用双蒸水补足至25 μL。检测体系在65℃反应60 min，最后在80℃加热10 min，灭活Bst DNA polymerase终止反应。

2.2.4阳性与阴性判定

肉眼观察产物颜色变化，出现明显绿色判定为阳性，橙色为阴性，橙绿色则再次取LAMP扩增，观察颜色变化；或通过2%琼脂糖凝胶电泳观察条带是否出现，电泳条带明显者判定为阳性，不明显者判定为阴性。

2.2.5特异性试验

采用建立的可视化LAMP检测体系分别对霍乱弧菌O139、副溶血弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌H4-3菌株DNA进行LAMP扩增，根据显色反应观察结果，检验方法的特异性。

2.2.6灵敏度试验

应用Nano DropND-100分光光度计测定霍乱弧菌O139基因组DNA含量，10倍倍比稀释基因组DNA原液至稀释为10-1～10-7，分别取10-2～10-7的基因组DNA 2 μL作为模板进行LAMP扩增，分析其灵敏度。

2.2.7样品检测

将150份各类水产品前处理预增菌后，提取细菌基因组DNA进行LAMP扩增和检测，同时被检水产品样品按照PCR的方法进行验证，以验证LAMP方法的可靠性和实用性。

3 结果与分析

3.1LAMP扩增特异性试验结果

特异性检测结果见图1a，霍乱弧菌O139基因组LAMP扩增出ctxA靶基因，反应管颜色变为绿色，其余7株其他菌株均未检测出ctxA基因，颜色没有发生变化，仍为淡橙色。电泳图见图1b。

图1　ctxA基因的LAMP特异性试验结果

3.2LAMP扩增灵敏性试验结果

基因组DNA含量检测结果显示，霍乱弧菌0139基因组DNA含量为8.1 ng/μL。10倍倍比稀释DNA原液进行LAMP检测，结果如图2a所示，随着菌液浓度的降低，生成颜色逐渐变淡（图2a），其特异性条带亮度也逐渐变弱（图2b），至稀释度10-5时仍能快速有效地扩增，10-5表明霍乱弧菌LAMP方法可扩增稀释至约81 fg/μL。

图2　ctxA基因的LAMP灵敏性试验结果

3.3样品检测应用

利用建立的LAMP检测方法对150份各类海产品进行检测，其中2份样品检出霍乱弧菌阳性（检出率1.3%），该结果与PCR结果一致，明显高于传统方法。

表2　霍乱弧菌在样品中的检出情况

4 讨论

目前国内外霍乱弧菌的检测方法尽管有很多，但各种方法都存在其自身的优势和局限性。常规的细菌培养、生化鉴定普及度广，但是操作既耗时又繁琐，同时由于细菌的生化特征相对不稳定，给鉴定带来了很大的困难和不确定性，易发生漏检现象；PCR技术虽具有特异性强，灵敏度高等优势，但成本较高、需要PCR仪等诸多不足而限制了其在现场和基层单位的应用；基因指纹图谱分析法所使用的检测试剂盒非常昂贵。微生物学检测工作者都不断地致力于建立简便、快捷、低廉的检测分析方法。

环介导等温扩增技术是由Notomi T［6］等人开发出来的一种新的核酸扩增方法，它依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，一般60 min内完成检测，大大提高检测工作效率［7，8］，具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点［9］，最大的优势依然在于其摆脱了对贵重仪器设备的依赖［10］，仅仅依靠金属浴或者水浴锅即可完成检测。国内学者建立的霍乱弧菌LAMP检测体系，在结果上或无法实现可视化，或釆用的可视化方法（幵盖加显色指示剂）容易造成污染的问题［11］。利用钙黄绿素进行显色，可在体系反应前加入，不需开盖，是LAMP法中较好的DNA染料物质［12］，可直接在白光下通过肉眼观察是否产生绿色的钙锰复合物来判断靶基因存在与否，它比以往在白光下通过肉眼观察是否有白色的焦磷酸镁沉淀更易于判断。

霍乱弧菌的致病因子主要是霍乱肠毒素（CT），由产毒型霍乱弧菌霍乱毒素基因（Cholera toxin gene，ctx）所编码的，是目前已知的致泻性毒素中最为强烈的毒素，是肠毒素的典型代表。霍乱毒素基因（ctx）被认为具有相当的保守性。因此本文通过针对霍乱毒素基因的其中一个亚单位ctxA基因设计了特异性的引物。结果表明，通过对不同细菌DNA模版进行LAMP扩增，只有霍乱弧菌O139反应管颜色变为绿色，其余7种细菌反应管颜色均未发生变化，仍为浅橙色，同电泳试验结果一致。通过灵敏度试验发现，最低检测浓度可达81 fg/μL，这一结果与文献报道的检测下限36.1 fg/μL［13］的基因组DNA基本相符。为进一步评价该方法的可行性及效果，对150份水产样本进行检测，霍乱弧菌检出率1.3%，检出率与PCR结果一致，比传统生化方法高。这是由于霍乱弧菌在某些不适合生长的条件下，可形成不可培养状态［14］，利用LAMP检测方法比传统的富集培养法更具有优势。

5 结论

本研究建立的可视化LAMP方法，不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，操作简单、所需模板量少、特异性强及可以快速获得大量特异性扩增产物，结果观察结合显色反应，直观准确，整个检测费用低，适合在广大基层实验室开展应用。

［1］纪惠玲，郭燕.霍乱弧菌分子生物学检测方法概述［J］.中国卫生检验杂，2007，17（1）：181-183.

［2］李红权，孙良娟，吴晓薇，等.环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究进展［J］.食品安全质量检测学报，2013，4（5）：1445-1420.

［3］董鑫悦，满朝新，卢雁，等.环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌［J］.食品工业科技，2013，34（5）：318-320，357.

［4］陈梅萍，孙晓红，姜文洁，等.环介导恒温扩增技术可视化检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌［J］.食品工业科技，2014，35（24）：71-75.

［5］Tomita N，Mori Y，Kanda H，et al.Loop mediated isothermal amplification（LAMP）of gene sequences and simple visual detection of products.Nature Protocols，20083（5）：877-882.

［6］NotomiT，OkayamaH，MasubuchiH，etal.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

［7］Branca A，Simonian P，Ferrante M，et al.Electronic nose based discriminationofaperfumerycompoundinafragrance［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2003，92（1）：222-227.

［8］Capelli L，Sironi S，Centola P，et al.Electronic noses for the continuous monitoring of odors froma wastewatertreatment plantatspecificreceptors：Focusontrainingmethods［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2008，131（1）：53-62.

［9］黄火清，郁昂.环介导等温扩增技术的研究进展［J］.生物技术，2012，22（3）：90-94.

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［13］Gao H，Lei Z，Jia J，et al.Application of loop-mediated isothermal amplification for detection ofYersinia enterocolitica in pork meat［J］.J Microbiol Methods，2009，77（2）：198-201.

［14］Roszak DB，Colwell RR.Survival strategies of bacteria in the natural environment［J］.Microbiol Rev，1987，51（3）：365-379.

Establishment and Application of Visual Loop-mediated Amplification Assay on Vibrio Cholera in Aquatic Product

Hu Xingjuan,Shen Biao,Zhou Xiujin,Shao Honghong,Zhang Jing,Zhu Yingwei
（Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhoushan，Zhejiang，316000）

In order to rapidly detect vibrio cholera in aquatic product,a visual loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay was developed with calcein/Mn2+.A set of primers was selected and the specificity and sensitivity was tested.The results showed that V.cholera with ctxA gene was amplified with typical color,and 7 strains of other bacteria concurred with V.cholera was not amplified.The detection limitation of this method was 81 fg/μL for purified genomic DNA.Furthermore,a total of 150 samples were tested by the established method and the virulence ctxA gene was detected from 2 samples, which was accordant with the PCR.This assay was lowered requirement for instrument and operator, suggesting good practical applicability,and suitable for detecting vibrio cholera in aquatic product.

Vibrio cholera；Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）；Visual；ctxA Gene；Detection

R446.5

E-mail：hxj@zs.ziq.gov.cn

浙江出入境检验检疫局科技计划项目（ZK201337）

2015-01-27