内质网应激与血管内皮细胞功能障碍关系的研究进展

何梦钰　左祥荣　解卫平

[摘要] 内质网是调控细胞蛋白质合成、钙稳态和细胞凋亡的重要细胞器，内皮细胞具有高度发达的内质网，越来越多的研究发现内质网应激参与内皮细胞功能障碍。多种病理状态如高同型半胱氨酸血症、高血流剪切应力、高脂血症、高血糖等都可引起内皮细胞发生内质网应激，适当的内质网应激通过激活未折叠蛋白反应恢复内质网稳态，而内皮细胞内质网功能的长期损伤将导致慢性内质网应激和未折叠蛋白反应，进而增加内皮细胞氧化应激和炎性反应，最终致死亡。由于内皮细胞在维持血管稳态中作用关键，其收缩舒张功能障碍，且内皮细胞分泌的血管活性物质失衡，是多种血管性疾病发病的重要环节，尤其在体循环高血压和肺高血压病理生理过程中起着关键作用。

[关键词] 内质网应激；未折叠蛋白反应；内皮细胞功能障碍；肺动脉高压

[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（c）-0030-05

[Abstract] Endoplasmic reticulum is an important organellein regulating protein synthesis， calcium homeostasis and apoptosis. It is known that endothelial cells have highly developed endoplasmic reticulum. Recently， a growing number of studies have found endoplasmic reticulum stress involved in endothelial dysfunction. A various pathological conditions including homocysteinemia， high blood flow shear stress， hyperlipidemia， high glucose can lead to endothelial dysfunction in part through theactivation of ER stress. Proper endoplasmic reticulum stress helps maintain the balance of endoplasmic reticulum by activating unfolded protein response， whilechronic activation of ER stress and UPR pathways inendothelial cells causes a rise of oxidative stress andinflammatory responses， eventually lendingto cell death. Endothelialcells play a crucial role in maintaining vascular homeostasis. It is theloss of normal systolic and diastolic function and the imbalance of endothelial-cell- secreted vasoactive substances that result in a variety of vascular diseases， especially systemic hypertension and pulmonary arterial hypertension.

[Key words] Endoplasmic reticulum stress； Unfolded protein response； Endothelialdysfunction； Pulmonary arterial hypertension

内质网（endoplasmic reticulum，ER）在许多细胞生命过程中起重要生理调控作用。越来越多的证据表明，ER功能障碍诱发的信号网络既能使细胞自适应，也可促细胞凋亡。病理条件下，ER稳态遭破坏，缓慢激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），长期的ER应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）参与许多疾病发生，包括神经退行性变，动脉粥样硬化，2型糖尿病，肝脏疾病和癌症[1-2]。正常内皮细胞在维护血管的通透性，调节组织与血液的物质交换，调节血管张力，调控炎性免疫反应，维持血流通畅等方面发挥重要作用。研究表明，内皮细胞功能障碍是多种心血管疾病发病的始动或促进因素[3]。近期多项研究强调ER稳态在维持内皮细胞功能中发挥重要作用。尽管急性ERS反应中UPR起到保护作用，但是病理性慢性ERS可导致内皮细胞损伤，随后发生炎性反应和细胞凋亡，导致内皮功能障碍，发生相关疾病。本文关注内质网应激和UPR与内皮细胞功能障碍发生的相关机制及其与血管性疾病尤其是是体循环高血压和肺高血压发病的联系。

1 内皮细胞功能障碍

血管内皮细胞不仅构成血管壁和管腔循环血液中成分之间的物理屏障，同时也维持血管稳态，促进物质转运及白细胞的跨壁转运。内皮细胞分泌大量维持血管正常功能所必需的调控因子，包括调节血管张力和血液凝固性，调控免疫反应，控制血管细胞生长的细胞因子。生理条件下，内皮细胞分泌一氧化氮（nitric oxide，NO），前列环素（prostaglandins，PGI），血栓调节蛋白，能抑制血小板聚集、平滑肌细胞增殖和白细胞黏附分子的表达，调节血管收缩与舒张。内皮细胞功能障碍是指内皮细胞在病理状态下（如高血脂、氧自由基、吸烟、高血流切应力等）出现血管活性物质合成释放间的失衡，如NO分泌减少及活性降低、PGI分泌减少、内皮素（endothelin，ET）分泌增多、内皮依赖性血管相关活性因子异常、内皮结构受损及凝血异常。内皮细胞功能障碍发生原因部分是由内皮细胞NO合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性降低，抗凝物质减少，黏附分子表达增加，趋化因子和细胞因子释放及活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增加引起。多种刺激如高血糖、胰岛素抵抗、高脂血症、血流紊乱和氧化应激都可导致内皮细胞发生ER应激。因此，内皮细胞损伤导致内皮细胞功能障碍是一系列病理过程发生的始动环节，与体循环高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭、外周动脉疾病、系统性硬化症（硬皮病）、糖尿病和肺动脉高压等多种疾病的发生发展有密切关系[4]。

2 内质网应激与未折叠蛋白反应

ER对维持细胞功能有重要作用，包括蛋白质折叠，脂质生物合成，钙平衡和氧化还原反应的动态平衡。生理条件下，ER蛋白质载量和其折叠能力相平衡。当未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔聚集，就会引起“未折叠蛋白反应”。由于蛋白质合成增加，错误折叠蛋白积累，ER钙离子及氧化还原反应的失衡，破坏ER稳态，称为ERS。细胞内UPR反应是一种细胞保护性机制，旨在恢复ER的平衡状态，维持细胞的正常功能。急性ERS有助于细胞存活，持久严重的ERS则导致细胞死亡[5-6]。

UPR信号感受器主要是三种跨膜蛋白受体：抑肽酶内质网激酶样激（pancreatic ER kinase RNA-like ER kinase，PERK），激活转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇依赖酶1（inositolrequiring enzyme 1，IRE1）。在生理状态下，这三种ERS感受器通过与内质网分子伴侣的免疫球蛋白重链（BiP）/GRP78（glucose regulated protein 78）结合而处于静息状态，一旦未折叠蛋白聚集，BiP便与这三个感受器解离，激活并触发UPR。PERK通过自身磷酸化和寡聚化激活，进而磷酸化真核翻译起始因子2α（elongation initiation factor 2α，eIF2α），导致除活化转录因子4（activatingtranscriptionalfactor4，ATF4）外整个细胞内翻译过程衰减。ATF4是参与恢复ER稳态的基因；然而，在慢性ERS情况下，PERK-ATF4通路诱导促凋亡介质CHOP（C/EBP homologous protein，也称为GAD D153）及其下游靶基因——DNA损伤诱导蛋白-34（DNA damageinducibleprotein-34，GADD34）表达。IRE1α是IRE1广泛表达的异构体，有激酶/核糖核酸酶双重功能，通过自身磷酸化和寡聚化激活，可剪切mRNA编码的X-box结合蛋白-1（x-box binding protein 1，XBP1）。XBP1的剪接异构体有转录因子的功能，诱导很多UPR反应必需基因的表达，从而提高ER折叠能力并扩展ER膜表面积。在慢性ERS过程中，IRE1通路持续激活，不但可以经过TRAF2（ tumor necrosis factor receptor-associated receptor 2）-ASK1（ apoptosis signal-regulating kinase 1）-JNK（ c-Jun N- terminal kinase）途径来激活JNK，诱导细胞凋亡；还可以直接或间接激活含caspase-12，进而激活caspase-9和caspase-3，诱导细胞凋亡。XBP1也协同ATF4-CHOP通路诱导细胞凋亡[5]。ERS过程中，ATF6转位至高尔基体，经S1P和S2P蛋白酶裂解，随后易位到细胞核并激活ERS相关基因。ATF6与XBP1也参与活化ER相关蛋白系统（ER associated degradation，ERAD）的降解过程，ERAD通过泛素-蛋白酶体途径消除错误折叠蛋白质[7]。

3 ERS参与多种病理状态下的内皮细胞功能障碍

缺血、缺氧、炎症、氧化应激等是导致ERS的主要因素，大量研究证实ERS参与了这些因素导致的内皮细胞功能障碍[8]。此外，ERS也参与了高同型半胱氨酸血症、高血流剪切应力、高脂血症、高血糖等因素导致的内皮细胞功能障碍。

3.1 高同型半胱氨酸血症

血浆中同型半胱氨酸升高是心血管系统疾病的一个独立危险因素。已证实同型半胱氨酸是ERS的诱导剂。虽然同型半胱氨酸诱导内皮细胞功能障碍的机制还未完全阐明，但IRE1/TRAF2途径和CHOP的上调激活JNK和ATF3可引起血管内皮细胞死亡；eIF2α诱导T细胞相关基因51（T-cell death-associated gene 51，TDAG51）介导的细胞间黏附功能的损伤也是诱发内皮细胞凋亡的途径。

3.2 血流剪切应力

Davies等[9]近期总结了血流紊乱和ERS/UPR通路激活间的关系，发现动脉粥样硬化高血流剪切应力区域的一个特征是发生慢性ERS和UPR通路的激活，且该区域易发生慢性炎性反应。分析UPR相关蛋白质表达提示尽管IRE1α和ATF6途径增加，但是PERK-ATF4分支途径并未被激活。因此，推测UPR对血流动力学紊乱有保护作用。

3.3 高脂血症

氧化的低密度脂蛋白（oxidized low density lipoproteins，OxLDL）可诱导内皮细胞凋亡，在动脉粥样硬化发展早期起重要作用。最近研究发现在严重动脉粥样硬化且脂质富集的病变区域有磷酸化的IRE1α，证实ERS/UPR途径可通过激活IRE1α-JNK通路促动脉粥样硬化发生。Gora等[10]用磷酸化的LDL处理人脐静脉内皮细胞发现UPR的三个信号途径以及白介素-6（IL-6）和IL-8均被激活。高脂血症患者产生的富含三酰甘油的脂蛋白（triglyceride-rich lipoproteins，TGRL）颗粒能增加人主动脉内皮细胞中血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表达，而健康人产生的TGRL颗粒可降低VCAM-1表达[11]。另有实验证明TGRL激活IRE1α-XBP1和PERK-eIF2α-CHOP通路促进粥样硬化发生。小干扰RNA抑制CHOP通路能够减少TNFα诱导的VCAM-1表达。此外，Dickhout等[12]用Sin-1处理人血管内皮细胞，模拟动脉粥样硬化病理状态，发现血管内皮细胞中GRP78/GRP94和TDAG51蛋白表达增加，同时eIF2α发生磷酸化，说明ERS参与了动脉粥样硬化的发生过程。

3.4 高血糖

高血糖可诱导内皮细胞发生氧化应激反应和ERS，导致ROS产生过多及后续的病理过程。Chen等[13]在链脲菌素（streptozotocin，STZ）诱导1型糖尿病模型中证实，炎性反应和血管渗漏发生的主要原因是ATF4介导的STAT3激活，而降低ATF4水平可抑制炎性反应和血管渗漏。另有细胞实验表明抑制STAT3可缓解高血糖促发的ERS，提示ERS和炎症通路间有相互调节作用。作者证明在STZ糖尿病模型中表皮生长因子受体酪氨酸激酶（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase，EGFR）的活化诱发ERS、微血管功能障碍和心肌纤维化，导致心血管并发症。EGFR磷酸化增加导致PERK-eIF2α-ATF4分支途径激活，但并不活化ATF6。药物抑制EGFR激酶活性可舒张肠系膜动脉，下调NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶4表达，提示EGFR是调控内皮细胞发生ERS上游的新位点[14]。

2型糖尿病是慢性炎症性疾病，ERS也参与2型糖尿病的病理过程。血糖升高及伴随的胰岛素抵抗使内皮细胞发生ERS，活化炎症信号通路，最终导致2型糖尿病相关的代谢障碍。ERS通过活化XBP1及ATF4，增加IL-8，IL-6及单核细胞趋化因子产生从而调控炎症相关基因的表达[15]。

研究发现当内皮细胞处于高糖环境时，CHOP介导的ERS活化胞内的NADPH氧化酶2，而NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶4的活化促进ROS二聚体的形成，进而使NO转变为ONOO-，且高糖环境激活ASK1，减少eNOS产生，导致内皮细胞功能障碍和凋亡[16-17]。

4 内质网应激介导的内皮细胞功能障碍在高血压疾病中的作用

4.1 体循环高血压

高血压时血流动力学的改变，缺血、缺氧和高压的发生以及血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、ET-1等生物活性因子增加都可激活血管内皮细胞ERS凋亡相关途径，导致细胞损伤和凋亡。Young等[18]第一次揭示了ERS在Ang-Ⅱ诱导的高血压模型中的作用。他们的研究专注于脑内ERS证明Ang-Ⅱ上调ERS的标志物，包括BiP/GRP78，PERK，CHOP。使用化学伴侣牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholic，TUDCA）治疗或局部补充ER分子伴侣Bip/GRP78可改善ERS并抑制Ang-Ⅱ诱导的高血压。此外，ERS抑制剂TUDCA或4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）通过降低生长转化因子α（TGFα）活性、增加eNOS磷酸化减少心肌纤维化，改善大血管内皮细胞功能。TUDCA或4-PBA抑制ERS对自发性高血压大鼠有明显降低血压的作用[19]，ERS通过增强ERK1/2和磷脂酶A2的磷酸化促进环氧酶-1的表达和PGI产生。抑制ERS可减少血管活性物质前列腺素物质产生从而改善血管内皮依赖性的收缩反应[19]。

4.2 肺高血压

肺高血压（pulmonary hypertension，PH）是一大类由多种病因引起，以肺血管床结构和（或）功能改变，导致肺循环压力升高直至出现右心衰竭和死亡为特征的临床综合征，包括肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）、肺静脉高压（pulmonary venous hypertension，PVH）和混合性肺高压三种[20]。越来越多的证据表明失调的ROS和NO信号通路与PAH发病相关联。氧化应激反应在PH病理过程中起核心作用，针对磷酸二酯酶5抑制剂，前列腺素类似物，ET受体阻断剂是PAH的常规疗法[21]。然而，ERS和UPR在PH中的致病作用近期才被关注[22]。系统性硬化相关PAH（systemic sclerosis-associated PAH，SSc-PAH）患者的肺血管内皮细胞和肺巨噬细胞中发现ERS标志物Bip和CHOP水平显著升高[23]。

在SSc-PAH，GATA6-KO小鼠模型中观察到ERS标志物表达增加。野生型小鼠在缺氧处理1个月后Bip和CHOP增加，而GATA6-KO小鼠缺氧处理一个月后肺动脉压力升高更显著，同时伴有广泛的肺血管重构和右心室肥大，且肺组织内皮细胞和巨噬细胞中BiP和CHOP表达上调，表明在缺氧状态下ERS和UPR主要发生在巨噬细胞和血管内皮细胞中[24]。ET-1是一种有效的血管收缩剂和促内皮细胞分裂剂，也受ERS途径的调节，是导致肺血管阻力增加和PH发生的重要致病因素。Lenna等[25]发现毒胡萝卜素通过增加ATF4/c-Jun转录复合物的形成上调内皮细胞中ET-1的表达。同时，在观察人类白细胞抗原-B35（HLA-B35）对内皮细胞的生物学效应中发现，GRP78/Bip、CHOP 可影响 ET-1的生成，参与内皮细胞功能障碍发生。Toll样受体3配体通过ATF4/c-Jun复合物介导ET-1的上调。对大鼠主动脉内皮细胞的研究发现，内皮细胞特有的依赖于ERS的ET-1表达上调，然而，ERS对ET-1的影响还有待进一步研究。

范小芳等[26]采用常压低氧法构建慢性低氧高二氧化碳性PAH大鼠模型，发现肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡明显增加，并且肺组织GRP78、GRP94、caspase-12 mRNA表达明显增加，免疫组化发现肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞GRP78、GRP94蛋白表达明显升高。因此，该研究认为ERS介导的肺血管内皮细胞凋亡与大鼠慢性低氧性PAH、肺血管重构的病理过程有关。

5 小结

内皮细胞作在维持血管稳态中起重要作用，其功能缺陷与多种心血管疾病的发生密切相关。目前，越来越多的研究关注ERS可能介导内皮细胞功能障碍，参与糖尿病、高脂血症、高血压和PH等多种疾病的病理过程，4-PBA和牛磺熊去氧胆酸两种化学伴侣可以抑制过度的ERS，改善内皮细胞功能障碍，并且在小的临床研究中显示出改善肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病[27]。相信，随着对ERS介导内皮细胞功能障碍机制研究的更加深入，会发现更有效而特异的ERS抑制剂，为预防和治疗高血压和PH等血管性疾病开辟新领域。

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（收稿日期：2015-06-08 本文编辑：苏 畅）