巴戟天薄层色谱鉴别用对照提取物的研制与应用

林锦锋　杨志业　李曼莎等

[摘要] 目的 研制薄层色谱鉴别用巴戟天对照提取物，以解决对照药材的局限性。 方法 从原料选定、制备工艺研究、稳定性影响因素考察等方面探讨薄层色谱鉴别用巴戟天对照提取物的研究思路，并比较巴戟天对照药材与对照提取物在薄层鉴别中的应用结果。 结果 巴戟天薄层鉴别用对照提取物的提取条件：巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加热回流提取，提取2次，每次1 h。该对照提取物替代对照药材应用于巴戟天及其成方制剂中的薄层鉴别效果一致。 结论 本研究制备的巴戟天薄层鉴别用对照提取物，可以替代巴戟天对照药材用于巴戟天及其成方制剂的质量控制分析。

[关键词] 巴戟天；薄层色谱鉴别；对照提取物；质量控制

[中图分类号] R927.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（c）-0022-05

[Abstract] Objective To develop Morinda officinalis How reference extract for TLC to solve the limitation of reference crude herb. Methods The research strategy of Morinda officinalis How reference extract for TLC was discussed from raw material selected， preparation technology and stability influence factors. Practical results between Morinda officinalis How reference crude drug and reference extract in TLC were compared. Results The extract condition of reference extract used for TLC of Morinda officinalis How was as follows： Morindae officinalis How thick powder was heating reflux extracted with 20 flods of 70% ethanol for two times， 1 hour each time. The reference extract instead of reference crude drug used for TLC of Morindae officinalis How and its historical preparations gained the same effect. Conclusion The reference extract of Morindae officinalis How for TLC prepared by this study can replace Morindae officinalis How reference crude herb to be used for quality control analysis of Morindae officinalis How and its historical preparation.

[Key words] Morindae officinalis How； TLC identification； Reference extract； Quality control

巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，始载于《神农本草经》，列为上品，为较常用的中药，有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿的作用，可用于阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、小腹冷痛、风湿痹痛、筋骨痿软[1-5]。其以肉质根入药，是我国著名的四大南药之一，在中医药处方中应用广泛，在我国南方地区以及港澳台地区还作为常用的食疗补品，为我国主要出口药材之一[6]。

目前，在《中国药典》及国家、地方的其他药材和成药标准中，主要采用对照药材和中药单体成分对照品作为薄层色谱鉴别项的对照物质，这种模式存在如下局限性：①对照药材品种有的黏度大难以粉碎均匀，粉碎后的稳定性降低，使用量过大，前处理麻烦或提取得到的供试品溶液含多种成分黏稠而难以点样等；②单体成分对照品较难获得，价格高昂且所能控制的成分单一。中药对照提取物价格低廉、多成分、专属性高、稳定性好、制备难度低，更符合中药的自身特点和质量控制要求，已经逐步成为近年来中药标准物质研究的新方向，黄芪、大黄、肉豆蔻、苦杏仁、龙胆、当归、川芎、七叶皂苷等中药对照提取物得到了研制应用[7-14]。

巴戟天属于含糖较多，不易粉碎均匀，且按《中国药典》标准提取得到的供试品溶液黏稠不易点样的品种。为克服上述局限，需要研究制备巴戟天薄层鉴别用对照提取物，并使之可在巴戟天药材及含巴戟天中成药的薄层鉴别项检测中替代巴戟天对照药材使用。

1 仪器与试药

样品：巴戟天药材样品5批（经广东省食品药品检验所林锦锋副主任中药师鉴定均为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根），样品信息见表1；巴戟天对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121163-201004）；喘可治注射液（广州万正药业有限公司，批号：12071801）。

仪器设备：数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，KQ-300DE型）、旋转蒸发仪（Heidolph，LABOROTA 4003）、薄层自动点样仪（Camag，ATS4）、薄层色谱成像仪（Camag，REPROSTAR 3）、电子天平（Sartorius，CP225D）、恒温恒湿培养箱（Binder KBF115）、药物稳定性试验箱（天津药典标准仪器厂，WD-1）。

试剂：纯水、试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 原料选定

因选取的原料用途是提取薄层色谱鉴别用对照提取物，故有针对性地对收集到的5批样品进行性状和薄层色谱鉴别项目的检测，比较检测结果，3号样品综合质量最优，故选取3号样品作为研制用原料。

2.2 工艺研究

巴戟天主要含蒽醌类化合物、环烯醚萜类化合物、多糖及低聚糖类、有机酸类等成分[15-17]，研究表明，巴戟天中的蒽醌类化合物具有防治糖尿病、骨质疏松等作用[18]，巴戟天多糖及低聚糖类具有增强免疫活性、抗抑郁、防治骨质疏松和促进雄性小鼠生精等作用[19-21]。本试验的工艺研究主要以蒽醌类化合物和糖类成分为考察指标。

2.2.1 不同提取溶剂考察 采用乙酸乙酯、乙醇和水3种溶剂进行提取试验，提取方法：取样品2 g，分别以乙酸乙酯、乙醇和水3种溶剂各20 mL加热回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解后作为供试品溶液。将提取所得的供试品溶液分别按《中国药典》（2010年版）一部“巴戟天”药材标准[1]项下的鉴别（2）和原国家食品药品监督管理局颁布的“喘可治注射液”标准[22]项下鉴别（2）分别进行蒽醌类成分薄层色谱检测[以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.1）为展开剂，展开，晾干，置254 nm紫外光下检视]和糖类成分薄层色谱检测[以正丁醇-无水乙醇-水（5∶4∶1）为展开剂，展开，晾干，喷以α-萘酚试液，105℃加热至斑点显色清晰]，结果表明，乙醇提取可以兼顾两种成分类别的提取，乙酸乙酯对蒽醌类成分提取较佳，但对糖类成分提取不佳；水则对糖类成分提取较佳，而对蒽醌类成分提取不佳。因此，初步选定乙醇为巴戟天薄层色谱鉴别用对照提取溶剂。

2.2.2 不同浓度乙醇考察 取样品5份，每份约5 g，分别以50%、60%、70%、80%、95%共5种不同浓度乙醇为溶剂各50 mL加热回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣称重计算提取效率，并用甲醇5 mL溶解后作为供试品溶液进行蒽醌类成分薄层色谱检测和糖类成分薄层色谱检测（色谱方法均同“2.2.1”）。结果70%乙醇提取得率最高（表2），且薄层色谱效果最佳，故确定最佳提取溶剂为70%乙醇。

2.2.3 不同提取方法考察 取样品2份，每份约5 g，各加70%乙醇50 mL，分别进行加热回流1 h和超声提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣称重计算提取得率，并用甲醇5 mL溶解后作为供试品溶液进行蒽醌类成分薄层色谱检测和糖类成分薄层色谱检测（色谱方法均同“2.2.1”）。对加热回流和超声提取这两种常用的提取方式进行考察，结果加热回流提取的得率高于超声提取（见表3），故采用加热回流的提取方式。

2.2.4 正交试验考察优化提取时间、次数及溶剂用量 为全面考察提取工艺条件，取样品6份，每份5 g，以70%乙醇加热回流提取，选择溶剂用量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，因素A的水平依次为10、15、20倍，因素B的水平依次为0.5、1、2 h，因素C的水平依次为1、2次，选用L6（32×2）正交表安排试验，以提取得率为考察指标，将结果填入正交试验表中的结果栏内，并进行直观分析和方差分析。由表4可知，RC>RA>RB，表明对提取得率的影响从大到小的顺序为：提取次数>溶剂用量>提取时间，最佳的试验方案为：20倍提取溶剂，回流提取2次，每次提取2 h。提取时间的影响最小，故结合直观分析和实际生产，适当减少提取时间为1 h，即最终确定的提取方案是巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加热回流提取，提取2次，每次1 h，减压回收溶剂至干。

2.3 批量制备

取巴戟天药材10 kg，按确定的提取方案制备，得对照提取物4.48 kg，得率为44.8%。每克提取物相当于2.23 g药材。

2.4 稳定性影响因素试验与包装条件确定

2.4.1 高温、高湿和强光照射试验 取样品按《中国药典》（2010年版）二部附录方法[23]进行高温、高湿和强光照射等稳定性影响因素试验，10 d后，从性状看高温条件下无明显变化，高湿条件下样品吸潮成稠膏状，强光照射下样品结块且颜色变深，而薄层色谱鉴别结果均符合规定，与0 d无明显差异。

2.4.2 氧化破坏试验 取本品2份，分别用5%、30%过氧化氢溶液进行氧化破坏试验。在性状方面经氧化破坏后，2份样品颜色均发生了明显变化，薄层色谱鉴别结果显示，5%过氧化氢溶液破坏后的样品与0 d样品无明显差异，但30%过氧化氢溶液破坏后的样品则与0 d样品不一致，说明样品在强氧化环境下不稳定。

2.4.3 包装条件的确定 上述稳定性影响因素考察结果表明，影响巴戟天薄层鉴别用对照提取物稳定性的主要因素有光照、湿度和氧化，包装应避光、密封，避免氧化和吸湿，故拟定该提取物包装条件为棕色玻璃安瓿瓶密封包装。

2.5 巴戟天薄层鉴别用对照提取物的应用

2.5.1 代替《中国药典》巴戟天药材标准中的对照药材 取巴戟天药材粉末2.5 g，加水1 mL使润湿，再加乙酸乙酯30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使之溶解后作为供试品溶液。另取巴戟天薄层鉴别用对照提取物1 g、巴戟天对照药材2.5 g，同法分别制成对照提取物溶液和对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一块硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果巴戟天药材样品、对照提取物和对照药材色谱结果基本一致（图1），表明对照提取物可以代替对照药材在该鉴别中使用。

2.5.2 代替喘可治注射液标准中的对照药材 取喘可治注射液2 mL，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取巴戟天薄层鉴别用对照提取物0.1 g，加甲醇10 mL超声处理30 min，滤过，滤液作为对照溶液。再取巴戟天对照药材0.25 g，加70%乙醇20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇10 mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以正丁醇-无水乙醇-水（5∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以α-萘酚试液，105℃加热至斑点显色清晰。结果对照提取物和对照药材色谱结果基本一致，喘可治注射液色谱中，在与上述两种色谱相应的位置上显相同颜色的斑点（图2），表明巴戟天对照提取物可以代替对照药材在该鉴别中使用。

3 讨论

3.1 巴戟天对照提取物与巴戟天对照药材的优劣比较

巴戟天对照药材的制备相对简单，但是使用时因其含糖分高而不易粉碎均匀，每次使用时的前处理较麻烦，提取得到的对照药材溶液较黏稠、不易点样。巴戟天对照提取物虽制备相对复杂，但均匀性较好，使用时前处理简单，薄层色谱结果与对照药材一致，既可以解决单体对照品难以获得且价格昂贵的问题，又可以达到多指标成分控制的目的，对巴戟天药材或处方中含巴戟天制剂的质量控制和标准执行都具有十分重要的意义。

3.2 巴戟天对照提取物的稳定性

本研究已经考察了巴戟天对照提取物的稳定性影响因素，并据此给出了包装条件，但对照提取物分装后的稳定性有待进一步进行加速稳定性考察或一般稳定性考察，从而确定其合理的使用期限。

3.3 更进一步的研究

本研究所制得的对照提取物可作为定性鉴别用标准物质，后续拟进一步将对照提取物的指标性成分（如耐斯糖）的含量进行标定定值，并考察确定使其均匀性、稳定性能够满足要求，将其制成既可用于定性又可用于定量的对照提取物，可替代高成本对照品的使用，降低标准物质的提取和纯化制备的成本，从而显著降低巴戟天药材及其制剂的质量控制成本。

3.4 中药对照提取物统一的技术规范

目前，《中国药典》收载的中药对照提取物的品种数量有限，其研制工作也没有统一的技术规范可依。作为标准物质的中药对照提取物，必须具备相对稳定的物质组成，保证在相同条件下色谱行为的稳定性和可重现性。因此，为了达到这一基本的技术标准，必须由权威部门制订发布相应的指导原则与技术要求来指导和规范中药对照提取物的研制。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：75-76.

[2] 肖培根.新编中药志[M].一卷.北京：化学工业出版社，2002：236-242.

[3] 况艳，周灿，廖莎，等.巴戟天炮制方法初探[J].西部中医药，2014，27（7）：138-140.

[4] 景海漪，史辑，贾天柱.巴戟天的炮制历史沿革[J].中国药房，2013，24（27）：2575-2577.

[5] 王馨，李晶，廖一兰，等.巴戟天水提物对老年痴呆模型大鼠的保护作用研究[J].中国药房，2013，24（31）：2908-2910.

[6] 陈彩英，詹若挺，陈蔚文.南药巴戟天源流考证[J].广州中医药大学学报，2009，26（2）：181-184.

[7] 周超，何轶，鲁静，等.黄芪异黄酮对照提取物的制备及其在黄芪药材含量测定中的应用[J].药物分析杂志，2014， 34（3）：523-528.

[8] 逄瑜.替代对照品法在中药大黄及部分含大黄制剂中的质量控制研究[D].北京：中国食品药品检定研究院，2014.

[9] 杨志业，李漫莎，林锦锋，等.肉豆蔻薄层色谱用对照提取物的制备与应用研究[C]//中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文集.广州：中华中医药学会，2014：398-402.

[10] 袁少雄，李向日.苦杏仁对照提取物替代苦杏仁对照药材的可行性研究[J].世界中医药，2015，10（2）：247-251.

[11] 玄敏，程雪梅，王长虹，等.龙胆和坚龙胆对照提取物的制备[J].中成药，2015，37（4）：746-751.

[12] 席骏钻，钱怡云，段金廒，等.对照提取物用于当归药材质量控制的研究[J].中国中药杂志，2014，39（19）：3803-3807.

[13] 吕维.川芎薄层鉴别用对照提取物的研究[D].成都：成都中医药大学，2014.

[14] 马玲云，陈红岩，肖新月，等.标示量值七叶皂苷对照提取物的研制[J].药物分析杂志，2014，34（7）：1278-1283.

[15] 陈美燕.巴戟天化学成分研究进展[J].云南中医中药杂志，2009，30（11）：63-64.

[16] 史辑，姜永粮，贾天柱.巴戟天属植物化学成分研究进展[J].广州化工，2009，37（9）：46-51.

[17] 陈红，陈敏，黄泽豪，等.巴戟天的化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（21）：69-71.

[18] 吴凌凤.巴戟天药材的质量评价研究[D].广州：广东药学院，2014：7-8.

[19] 刘亦恒，吴多庆，朱振标，等.巴戟天多糖对去卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用[J].海南医学，2014，25（20）：2973-2975.

[20] 刘汝银，岳宗进，包德明.巴戟天多糖对骨质疏松模型大鼠5-HT、VEGF与体内矿物质含量影响研究[J].中国生化药物杂志，2015，35（4）：59-62.

[21] 李丹青，肖强兵.巴戟天多糖通过p38MARK信号通路促间充质干细胞成骨分化的体外研究[J].中国中医骨伤科杂志，2015，23（5）：1-4.

[22] WS3-839-（Z-164）-2004（Z）-2012.喘可治注射液[S].北京：国家食品药品监督管理局，2012.

[23] 国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录199-附录200.

（收稿日期：2015-05-22 本文编辑：李亚聪）