长白山野生食用菌多糖抗突变作用的研究

李雪，金乾坤，李晓东，于婷，李鹏飞，严红实，崔承弼，3，*

（1.延边大学基础医学院，吉林延吉133002；2.延边大学农学院，吉林延吉133002；3.延边大学长白山生物资源与健康产业协同创新中心，吉林延吉133002）

长白山野生食用菌多糖抗突变作用的研究

李雪1，金乾坤1，李晓东1，于婷1，李鹏飞1，严红实2，崔承弼2，3，*

（1.延边大学基础医学院，吉林延吉133002；2.延边大学农学院，吉林延吉133002；3.延边大学长白山生物资源与健康产业协同创新中心，吉林延吉133002）

利用产自长白山地区的五种野生食用菌：桑黄、灵芝、桦褐孔菌、猴头菇和榛蘑为主要材料。从中提取食用菌粗多糖并进行抗突变实验，以期为食用菌保健品的开发以及精细加工提供理论参考。

食用菌；Ames试验；微核试验；抗突变

在菌类中，我们将可以作为食物食用的大型真菌的菌核组织和子实体称为食用菌，食用菌不但具有食用价值，被人们认为是具有“低糖、低盐、低脂肪、高蛋白”的绿色食品，而且还具有药用价值，常在传统中药处方中与其他药食材料配伍［1］。那些在自然界中以完全野生的状态生长在深山老林中的优质食用菌被称为野生食用菌，这类食用菌往往含有更多的氨基酸、蛋白质、矿物质、糖类、维生素及其他营养物质［2］。

长白山位于吉林省东南部地区，充沛的降雨量，适宜的气候，肥沃的土壤使其成为各种珍稀动植物资源的天然宝库。长白山地区可供药食两用的菌类有200多种，其得天独厚的地理优势为野生食用菌的生长提供了基础［3-4］。松茸，猴头菌，元磨，榛蘑，木耳等均被视为长白山地区的珍品，不但味道鲜美而且营养价值极高，都是百姓比较喜欢食用的野生食用菌［5］。

食用菌多糖具有多种药理活性，如抗肿瘤、降血压、降血糖以及提高机体免疫力等。基于以上功效，食用菌多糖被广泛用于医药保健等方面，是一种天然的免疫增强和激活剂［6］。黑木耳中提取的多糖可以显著降低高血脂小鼠的低密度脂蛋白和胆固醇［7］。某些食用菌多糖可以促进肝胆循环，平衡肝内组织生成的酮和肝外组织利用限度，同时减少血液中血脂的累积［8］。此外有研究证实，食用菌多糖可以通过提高抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化水平及清除体内自由基来达到保护生物膜和延缓衰老的作用。

长白山地区的野生食用菌在地方预防疾病方面发挥着重要的作用，但由于保存方法及生产方式等众多原因使其开发利用率较低。本实验从五种长白山地区野生食用菌中提取食用菌粗多糖进行抗突变实验的研究，以期为长白山地区野生食用菌的研究提供新的理论参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

桑黄、灵芝、桦褐孔菌：购于安图县市场；猴头菇、榛蘑：购于延吉市西市场。N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）、4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQQ），美国SIGMA公司生产；注射用环磷酰胺，山西普德药业股份有限公司；Giemsa色素，天津博迪化工有限公司；其他常规药品均为化学纯或分析纯。

1.2仪器

BH2型生物显微镜：日本OLMPUS公司；GT10-1型低温高速离心机：北京时代北利离心机有限公司；HF-150A型恒温培养箱：金坛市恒丰仪器厂；SB-2000型旋转蒸发仪：上海爱郎仪器有限公司；YXQ-LS-75S11立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限责任公司医疗；全膜终端过滤独立送风净化笼具（IVC）：苏州新区枫桥净化设备厂；A-1000型水流抽气机：上海爱郎仪器有限公司；DHG-9143BS-III型电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；MCO96型CO2培养箱：上海贝基生物科技有限公司，等。

1.3试验菌株

Ames试验标准菌株TA98和TAl00，购置于Ames实验室。菌株经组氨酸缺陷、脂多糖屏障缺陷、R因子、四环素抗性、uvrB修复缺陷及自发回变率鉴定，菌株特性良好符合试验要求。

1.4试验动物

小鼠：试验动物为昆明种，清洁级，体重18 g～22 g的小鼠，雌雄各半，由延边大学实验动物中心提供。小鼠在动物实验室全膜终端过滤独立送风净化笼具内适应饲养3 d，自由摄食饮水，室温20℃～24℃，相对湿度为40%～65%，每隔1天更换垫料。

1.5试验方法

1.5.1粗多糖的制备

称取食用菌1 kg加入10倍水后用液体真空浓缩煎药机提取2 h，重复提取一次，真空浓缩滤液至原体积的1/5，加入3倍量的无水乙醇，放置4℃冰箱24 h，4 000 r/min离心10 min，弃上清液，用丙酮和75%乙醇洗涤沉淀，合并后至于60℃下真空干燥成粗多糖［9］。

1.5.2Ames试验

分组及给药：试验设4个剂量组，分别为50、100、150、200 μg/皿的食用菌多糖，同时设溶剂对照组与阳性诱变剂对照组，每组设3个平皿。诱变剂选用MNNG、4NQO，食用菌多糖与诱变剂均用二甲基亚砜配成0.1 mg/mL溶液。

具体操作：在约45℃的2 mL顶层培养基中加入0.1 mL菌液混匀，加入0.1 mL受试物，再加入0.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4）。迅速混匀，快速倾入底层培养基中，待上层琼脂凝固后，将平板翻转，37℃温度下培养48 h后，观察实验结果［10-12］。食用菌粗多糖浓度和突变物质浓度通过预备实验来确定，抗突变活性通过其对突变物质样品活性的抑制率（%）表示。

回复突变抑制率（%）=（阳性对照组菌落数-试验组菌落数）/阳性对照组菌落数×100%

1.5.3微核试验

动物适应性饲养2 d～3 d后，将健康状况良好且体重为18 g～24 g的昆明种小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半。小鼠骨髓细胞微核试验分为阴性对照组、环磷酰胺阳性对照组和1 000 mg/kg·BW的五种野生食用菌多糖实验组。食用菌多糖按0.1 mL/10 g灌胃给药，连续给药10 d，对照组同时以蒸馏水灌胃。试验末期给予阳性对照组环磷酰胺腹腔注射2次，时间间隔为24 h，于末次给药6 h后将各试验组动物颈椎脱臼处死。

小鼠骨髓细胞微核抑制试验分为阴性对照组、阳性对照组和野生食用菌多糖500、1 000 mg/kg·BW 2个剂量组。食用菌多糖按上述剂量灌胃，方法与上述相同。

处死小鼠，取两腿股骨，剔除肌肉，剪断股骨两端的骨骺后，将吸取适量胎牛血清的1 mL注射器插入骨髓腔内，将骨髓冲入已编完号的载玻片上，用另一块载玻片将胎牛血清上的骨髓细胞分散均匀。然后以45°进行涂片，长度约为2 cm～3 cm，在室温下放置晾干。在用甲醇中固定时间约为10 min，然后用Giemsa应用液A染色约15 min后立即用Giemsa应用液B冲洗，自然干燥后保存［13-14］。在油镜下观察含有微核嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示，抑制率公式如下：

2结果

2.1五种野生食用菌多糖Ames试验的抗突变性

2.1.1五种野生食用菌多糖MNNG诱导的TA100的抗突变效果

对五种食用菌多糖进行前期试验，当以MNNG和4NQO做为直接致突变剂进行Ames试验时均没有致突变性。如图1所示在MNNG（0.4 μg/plate）诱导的TA100试验中，最高浓度200 μg/plate时其抗突变作用达到70%以上。

图1　5种食用菌多糖对MNNG诱导的TA100的抗突变抑制效果Fig.1The inhibition effect of anti-mutation of MNNG induced by five kinds of mushroom polysaccharides on TA100

2.1.2五种野生食用菌多糖对4NQO诱导的TA98、TA100的抗突变效果

4NQO诱导的TA98、TA100试验结果如图2、图3所示。

图2　5种食用菌多糖对4NQO诱导的TA98的抗突变抑制效果Fig.2The inhibition effect of anti-mutation of 4NQO induced by five kinds of mushroom polysaccharides on TA98

图3　5种食用菌多糖对4NQO诱导的TA100的抗突变抑制效果Fig.3The inhibition effect of anti-mutation of 4NQO induced by five kinds of mushroom polysaccharides on TA100

在4NQO诱导的TA98实验中，当多糖浓度达到最高（200 μg/皿）时桦褐孔菌显示出80%以上的抑制率；而在TA100实验中，桑黄多糖和桦褐孔菌多糖抑制率均达到了90%。此外，可以发现随着浓度的增加其抗突变作用也明显增强。

2.1.3五种野生食用菌多糖混合物的抗突变效果

将五种食用菌多糖按相同比例混合溶解后，以MNNG和4NQO为致突变剂进行了Ames试验。结果表明多糖混合物没有致突变性，于是对其抗突变作用进行进一步试验。图4 MNNG（0.4 μg/皿）诱导TA100的试验中，多糖最高浓度为200 μg/皿时抗突变作用达到75.9%。4NQO诱导的TA98、TA100试验结果如图5所示。

图4　5种食用菌多糖混合物对MNNG诱导的TA100的抗突变抑制效果Fig.4The inhibition effect of anti-mutation of MNNG induced by five kinds of mushroom polysaccharides mixture on TA100

图5　5种食用菌多糖混合物对4NQO诱导的TA98、TA100的抗突变抑制效果Fig.5The inhibition effect of anti-mutation of 4NQO induced by five kinds of mushroom polysaccharides mixture on TA98 and TA100

混合多糖浓度在200 μg/皿时TA98、TA100的突变抑制率分别达到67.9%和76.7%。其抗突变作用随着多糖浓度的增加而有所增强。

2.2五种野生食用菌多糖的小鼠微核试验

五种野生食用菌多糖的小鼠微核试验见表1。

表1　食用菌多糖小鼠微核试验Table 1Micronucleus test on mice fed with mushroom polysaccharides

续表1食用菌多糖小鼠微核试验Continue table 1Micronucleus test on mice fed with mushroom polysaccharides

由表1可以看出，本实验选用小鼠的自发微核率为（2.4±0.48）‰，介于0‰～4‰之间，自发微核率低且比较稳定因此可以选做微核试验。环磷酰胺组形成的微核数量较多且与空白组有显著性差异（p＜0.05），可以看出50 mg/kg·BW剂量的环磷酰胺可以诱发小鼠骨髓微核形成，而五种食用菌多糖组微核率均在正常范围内，且与空白组相比无显著差异（p＞0.05）。说明五种食用菌多糖的摄入对微核的形成没有影响，即五种食用菌多糖没有致突变性。

5种食用菌多糖抑制小鼠骨髓细胞微核形成的作用结果如表2所示。

表2　食用菌多糖抑制小鼠微核试验Table 2The inhibition micronucleus test on mice fed with mushroom polysaccharides

5种食用菌多糖两个剂量组与环磷酰胺对照组相比微核率显著下降（p＜0.05），且高剂量组微核率比低剂量组微核率低，说明其抑制率更高。此外，桦褐孔菌多糖与灵芝多糖的为500 mg/kg·BW时对小鼠骨髓微核的抑制作用最好，抑制率分别达到77.0%和70.1%。因此可以看出五种食用菌多糖对环磷酰胺所引起的染色体损伤具有保护作用。

3结论

食用菌多糖的抗突变试验结果显示其具有较高的抗突变活性。本实验从细菌回复突变和体细胞染色体改变两个不同的角度对长白山地区野生食用菌的致突变性和抗突变性进行了研究。以上实验结果可证实食用菌多糖具有一定的抗突变作用，即长白山地区的这五种野生食用菌不仅是天然绿色的食品同时也可用于相关药物研发。因此长白山地区的野生食用菌可以作为安全绿色的药食同源材料进行进一步精加工，其用于新型功能性食品将具有很大的开发前景。

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Study on the Anti-mutation Effect of Changbai Mountain Wild Edible Fungus Polysaccharide

LI Xue1，JIN Qian-kun1，LI Xiao-dong1，YU Ting1，LI Peng-fei1，YAN Hong-shi2，CUI Cheng-bi2，3，*
（1.School of Basic Medical Science，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China；2.Dept.of Agriculture，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China；3.Center of Co-Innovation for Natural Resources of Changbai Mountain&Health Industry，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

In this study，we used five wild edible mushroom in Changbai Mountain area as follows：Phellinus igniarius，glossy ganoderma，Inonotus obliquus，Hericium erinaceus and mellea armillaria sporophore. Extracted mushroom polysaccharide from the five wild edible mushroom for the anti-mutation experiments，there would be a theoretical basis for the development of edible mushrooms in health products and precision machining.

edible mushroom；ames test；micronucleus test；anti-mutation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.034

2014-06-11

国家自然科学基金项目（31160314）

李雪（1990—），女（汉），在读研究生，研究方向：功能性食品的研究。

崔承弼（1968—），男，教授，博士。