三种低聚果糖检测方法的比较

张媛媛，张彬，韩爱云，张文娜，俞龙泉

（石家庄学院，河北石家庄050035）

三种低聚果糖检测方法的比较

张媛媛，张彬，韩爱云，张文娜，俞龙泉

（石家庄学院，河北石家庄050035）

通过对纸层析法，高效液相色谱-示差检测法和高效液相色谱-蒸发光散射检测法三种低聚果糖检测方法进行对比研究。结果发现，高效液相色谱-蒸发光散射检测法分离度高，重现性和准确性好，操作相对简单易行，优于其它两种方法。该方法采用氨基柱，流动相为乙腈与水，采用梯度洗脱，流速设定1.0 mL/min。ELSD的漂移管温度设定85℃；载气为空气，流速2.0 L/min。低聚果糖各组分的回收率范围为97.73%～99.39%，日内精密度＜1.2%；日间精密度＜2.8%。高效液相色谱-蒸发光散射检测法简便快捷，准确性，重现性好，更适合于低聚果糖的检测。

高效液相色谱；蒸发光散射检测；低聚果糖

低聚果糖（fructooligsacchrides，FOS）是果糖基通过β-1，2糖苷键连接而成的功能性低聚糖，其主要成分为蔗果三糖（GF2），蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）［1］，具有充当双歧杆菌和乳杆菌的生长因子，提高肠道有益菌群数量，从而改善人体内肠道环境，防止腹泻与便秘等生理功能［2-3］。目前，低聚果糖作为一种功能因子广泛应用于奶粉、饮料、糖果等食品领域。为了实现对食品中所含的低聚果糖的含量进行定量分析，因此寻找到一种快速、稳定、实用性强的低聚果糖检测方面也变得十分重要。

前人研究结果中，甘宾宾等用高效液相色谱-示差检测法，以乙腈、水为流动相，对低聚果糖进行了检测［4］。唐军等采用纸层析法对低聚果糖进行了检测［5］。高效液相色谱-蒸发光散射检测法作为一种新型检测方法在低聚果糖检测方面应用不广，而且上述文献都是采用单一方法对低聚果糖进行测定，缺少不同方法之间的横向比较。目前，还没有对于低聚果糖检测方法横向比较的研究报道。本研究拟对高效液相色谱-蒸发光散射检测法、纸层析法和高效液相色谱-示差检测法三种检测方法进行研究对比，得到一种更灵敏，准确，快速的低聚果糖分析方法。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

低聚果糖标准品：蔗果三糖（GF2，纯度99%）、蔗果四糖（GF3，纯度99%）、蔗果五糖（GF4，纯度88%），日本岛津株式会社；低聚果糖样品：苏州鑫发生物科技有限公司；乙腈：色谱纯；正丙醇、醋酸乙酯、磷酸、α-萘酚溶液、活性炭、硅藻土、乙醇：上海国药集团化学试剂有限公司；新华三号滤纸；

1.1.2主要仪器设备

高效液相色谱仪（Agilent 1100）、示差检测器：安捷伦公司；蒸发光散射检测器（ELSD-UM 3000）：上海通微科技有限公司；电子天平（AL 204）：瑞士梅特勒-托利多公司；721型分光光度计：上海精科；超声波清洗器（YQ-520 A）：上海易净超声波仪器有限公司；色谱柱：NH2分析柱（4.6 mm×300 mm，5 μm），沃特世科技（上海）有限公司（Waters）。

1.2方法

1.2.1低聚果糖标准溶液配制

称取蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖标准品各200 mg，分别放入10 mL容量瓶，用超纯水稀释至刻度，超声处理3 min后，用0.50 μm滤膜过滤。然后，取等量已配好的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的标准溶液至容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，超声处理3min后，用0.50 μm滤膜过滤，备用。

1.2.2低聚果糖样品溶液配制

称取一定量的样品，用超纯水稀释至刻度，超声处理5 min后，用0.50 μm滤膜过滤，备用。

1.2.3纸层析检测法

将低聚果糖标准液点样于新华三号滤纸，点样量10 μL，放置于层析缸中，展开剂为：V正丙醇∶V醋酸乙酯∶V水=8∶1∶1，待层析液上行至距滤纸顶端1 cm左右时，取出用电吹风吹干后，均匀喷洒显色剂（含10%磷酸的1%α-萘酚溶液），放于烘箱中干燥显色，斑点显出后，剪下显色斑点于带塞的玻璃试管中，用10 mL的洗脱液（去离子水和乙醇溶液）洗脱一定时间，然后在721分光光度计上测定其吸光度，计算其含量。

1.2.4高效液相色谱-示差检测器检测法

采用乙腈（75%）：水（25%）为流动相；设定流速，1.0 mL/min；进样量，10 μL；柱温，40℃。

1.2.5高效液相色谱-蒸发光检测器检测法

采用乙腈与水为流动相；设定流速，1.0 mL/min，梯度洗脱；进样量，10 μL；柱温，室温；ELSD的漂移管温度，85℃；载气，空气；流速，2.0 L/min。

2结果与分析

2.1纸层析检测法

2.1.1定性分析

经实验观察，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖全部呈现紫青色，斑点清晰，表示该方法可以用于低聚果糖的定量分析。

2.1.2定量分析

取同一样品，分别进行三次定量分析，实验结果见表1。

表1　重现性实验Table 1Reproducibility Test

实验结果显示，采用纸层析检测法进行定量分析时，由于受实验方法自身精确度限制，以及环境影响和操作误差影响，导致实验结果重现性较差，样品检测含量波动较大，其RSD均在5%以上，稳定性不佳。

2.2高效液相色谱-示差检测器检测法

按照1.2.3.1的色谱条件对样品进行分析，发现蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖由于分子结构特征及理化特性十分相近，出峰时间存在重叠，洗脱效果不好，而且示差折光检测器受检测环境的影响很大，检测灵敏度低。这一实验结果与文献报道相符［6］。

2.3高效液相色谱-蒸发光检测器检测法

2.3.1ELSD参数的选择

漂移管温度和雾化气体流量是影响ELSD两个重要因素。雾化器的气体流速决定雾化时液滴的大小，从而影响基线噪声。漂移管温度决定了样品的挥发程度，从而影响样品的响应信号。实验通过观察样品分离度以及计算最佳信噪比（S/N），选择漂移管温度85℃，载气流量2.0 L/min。

2.3.2流动相条件选择

采用乙腈、水为流动相。由于要检测的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的结构和性质相似，在采用等度洗脱时，发现水相比例较大时，峰有重叠，不能达到较好的分离度；为了使低聚果糖达到较好的分离度，实验采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～20 min（70%～65% A，30%～35%B），20 min～22 min（65%A，35%B），22 min～25 min（65%～70%A，35%～30%B），25 min～28 min（70%A，30%B）。色谱图见图1。

图1　低聚果糖标准品的HPLC-ELSD色谱图Fig.1Representative HPLC-ELSD chromatograms of FOS

2.3.2方法学考察

2.3.2.1回归方程、线性关系、检出限（LOD）与定量限（LOQ）

将低聚果糖标准溶液稀释至不同浓度，按2.2的色谱条件进行检测，计算得回归方程，见表2。

表2　低聚果糖的回归方程、线性关系、检出限与定量限Table 2Calibration curve，correlation coefficient，linear range，LOD and LOQ of FOS

实验结果表明，回归方程的相关系数均在0.999 5以上，表明方程是准确可信的，线性范围在0.67 μg～14.0 μg。

2.3.2.2精密度实验

取一定量的低聚果糖标准溶液，按2.2的色谱条件进行精密度实验，实验结果见表3。

表3　日内精密度实验与日间精密度实验结果Table 3Intra-and inter-day variations of HPLC-ELSD method

实验结果表明，日内精密度实验RSD值均小于1.2%，日间精密度实验RSD值均小于2.8%，说明该检测方法稳定，重现性很好，适用于低聚果糖的定量检测。

2.3.2.3加标回收率实验

取一定量的样品溶液，加入一定量的标准品，混合均匀，按2.2的色谱条件进行含量测定，计算回收率，实验结果见表4。

表4　回收率实验结果Table 4Accuracy of HPLC-ELSD method

实验结果表明，低聚果糖各组分的回收率范围为97.73%～99.39%，其RSD值均小于1.4%。

3结论

通过实验研究发现，采用纸层析检测法对低聚果糖进行检测，可以对其进行定性分析；但由于纸层析检测法精确度低，容易受环境和操作误差影响，实验结果重现性较差，表明该方法不适合用于低聚果糖的定量分析。

高效液相色谱-示差检测法受环境影响较大，灵敏度低，且无法采用梯度洗脱，由于蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖由于分子结构特征及理化特性十分相近，导致出峰时间存在重叠，洗脱效果不好，表明该方法不适合用于低聚果糖的定性定量分析。

高效液相色谱-蒸发光检测法是一种新型检测方法［7-8］，其工作原理依据检测样品中不挥发的固体颗粒产生的散射光信号强度与其质量成正比这一原理进行检测分析。在低聚果糖检测方面显示出明显的优越性，并且在多梯度的情况下能够获得稳定的基线和较低的噪音，达到理想的分离度［9-10］。低聚果糖各组分的回收率范围为97.73%～99.39%，日内精密度＜1.2%；日间精密度＜2.8%。

综上所述，高效液相色谱-蒸发光散射检测方法分离度高，重现性和准确性好，操作相对简单易行，优于其它两种方法，更适合于含有低聚果糖的食品的检测。

［1］黄磊，陈山.日本曲霉和黑曲霉发酵甘蔗糖蜜和酵母粉生产低聚果糖［J］.广西蔗糖，2012，36（4）:38-43

［2］惠伯棣，李京，郑康成，等.蒸发光散射检测器在番茄红素反相HPLC定量分析中的应用［J］.食品科学，2006，27（2）:226-229

［3］张悦晗，甄汉深，成莉.蒸发光散射检测器（ELSD）应用概况［J］.中华中医药学刊，2007，25（4）:831-833

［4］甘宾宾.高效液相色谱法测定低聚果糖的组分［J］.色谱，1999，17（1）:87-89

［5］唐军，储炬，李友荣.低聚果糖的检测及其生产菌株的筛选［J］.中国医药工业杂志，1998，29（4）152-155

［6］于晓瑾，仇凯，熊正河.食品中低聚果糖和低聚半乳糖检测方法研究进展［J］.食品研究与开发，2013，34（20）:125-129

［7］王一博，王春雨，曲范娜，等.高效液相色谱-电雾式检测器同时测定猪、牛、羊、熊胆粉中5种胆汁酸的含量［J］.分析化学，2014，42（1）:109-112

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［10］李海龙，王静，张英春，等.HPLC-ELSD法测定苦杏仁中苦杏仁苷的含量［J］.食品与发酵工业，2007，33（1）:109-112

Comparison of Three Methods for Determination of Fructooligosaccharides

ZHANG Yuan-yuan，ZHANG Bin，HAN Ai-yun，ZHANG Wen-na，YU Long-quan
（Shijiazhuang University，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

A High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection method was compared with Paper Chromatography method and High Performance Liquid Chromatography-Refractive Index Detection method in this study.The comparison result showed that the High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection method was significantly better than the other two methods.The experimental conditions were showed as follows：Compounds were successfully separated on a Waters NH2column（4.6 mm）by a gradient elution.Acetonitrile and water were selected as the mobile phase A and B with a flow rate of 1.0 mL/min.The parameters of ELSD were set as follow：drift tube temperature was 85℃，air carrier gas flow rate was 2.0 L/min.The result showed that good separation effect was obtained and the recoveries were ranging from 97.73%to 99.39%.The intra-day precision（RSD）was less than 1.2%and the within-day precision（RSD）was less than 2.8%.The method showed good separation effect，accuracy，reproducibility，and suitable for the detection of fructooligosaccharides in practice.

high performance liquid chromatography；evaporative light scattering detection；fructooligosaccharides

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.025

2015-05-20

石家庄学院博士科研启动基金项目（NO.13BS014）资助

张媛媛（1983—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：食品分析与食品安全，功能性食品研究与开发。