响应面法优化凤丹籽饼粕中单萜苷的超声提取工艺

邓瑞雪，李小方，刘一琼，曾　猛，董俊青，刘　普

（河南省伏牛山野生药材基源工程技术研究中心，河南科技大学化工与制药学院，河南洛阳471023）

响应面法优化凤丹籽饼粕中单萜苷的超声提取工艺

邓瑞雪，李小方，刘一琼，曾猛，董俊青，刘普*

（河南省伏牛山野生药材基源工程技术研究中心，河南科技大学化工与制药学院，河南洛阳471023）

为确定凤丹籽饼粕中单萜苷的最佳超声提取工艺条件，研究了超声时间、乙醇体积分数和液料比3个主要因素对单萜苷提取率的影响。在单因素实验基础上，采用响应面法对超声提取凤丹籽饼粕中单萜苷的工艺参数进行优化。得到最佳工艺条件为：超声时间35min，乙醇体积分数为41%，液料比为35∶1（mL/g），在此工艺条件下的单萜苷的得率为7.089%。

凤丹，籽饼粕，单萜苷，超声波辅助提取，响应面法

凤丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）又名杨山牡丹，凤丹牡丹，属于芍药科牡丹组革质花盘亚组，为我国特产的传统名花和药用植物，是中国栽培牡丹品种的近缘野生种之一［1］。2011年3月，国家卫生部批准来自丹凤（P.ostii T.Hong et J.X.Zhang）和紫斑牡丹（P.rockii）的籽仁油可以作为新资源食品应用［2］。凤丹籽油中含有丰富的对人体健康非常有益的不饱和脂肪酸［3］，具有非常重要的保健及药用价值。凤丹籽榨油后必将会产生大量的籽饼粕，针对这些凤丹籽饼粕的研究开发利用将是一个崭新的研究课题。

据报道，芍药属植物中含有较多的单萜苷类化合物，如芍药苷、白芍苷等［4-8］。并且，本课题组前期对凤丹籽饼粕化学成分的研究中也分离得到了大量单萜苷类化合物，包括芍药苷、氧化芍药苷、白芍苷等［9］。

超声提取技术为一种较新型的提取方法，与传统的溶剂浸提方法比较，其具有缩短提取时间、提高提取效率等优点，已经广泛应用于植物有效成分的提取中［10-14］。单萜苷类物质过去多从芍药属植物的根或根皮中得到［15-16］，且该类化合物具有较好的生物活性［17-19］，因此从凤丹籽饼粕中提取单萜苷类化合物不仅可以充分利用榨油后的废弃资源，还可以减少对凤丹植株的采挖，实现资源的可持续利用。本实验采用响应面法对凤丹籽饼粕中单萜苷类化合物的超声提取工艺进行了优化，以期获得较高的得率，为单萜苷类成分在药品和食品领域里的应用研究提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

凤丹籽饼粕由洛阳全福食品有限公司提供，为不脱壳凤丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）籽榨油后的剩余部分；无水乙醇、甲醇分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；苯甲酸（纯度99.5%） 分析纯，阿拉丁试剂；二次蒸馏水本研究室自制。

Ymnl-2008DE智能温控双频超声波萃取仪南京以马内利仪器设备有限公司；FR2004B电子天平上海越平科学仪器有限公司；YXJ-A高速大容量电动离心机江苏金坛市环宇科学仪器厂；FW100型高速万能粉碎机天津泰斯特仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1原料的预处理将采用压榨法榨油后剩余的凤丹籽饼粕置于烘箱中，在80℃下烘至恒重，粉碎至40目，放置在干燥器中备用。

1.2.2苯甲酸标准曲线绘制精密称取0.0100g苯甲酸，加甲醇溶解并定容至100mL，摇匀，备用。向5个50mL容量瓶中分别移入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5mL苯甲酸溶液，继续加入甲醇定容，摇匀，用紫外分光光度仪测其在228nm处的吸光度，甲醇作对照。以提取物的甲醇溶液浓度（μg/mL）为横坐标，溶液在228nm处的吸光度为纵坐标作标准曲线，得到回归方程为Y= 0.0965A+0.1961，相关系数为R2=0.9994。

1.2.3单萜苷类化合物的提取精密称取2.0g凤丹籽饼粕粉末若干份，以一定体积分数的乙醇溶液为提取溶剂，分别在不同的乙醇体积分数、液料比和超声提取时间下进行超声提取。提取液在8000r/min条件下高速离心10min，小心取出离心管，吸取上清液在60℃条件下旋转蒸发除去乙醇，待蒸发完全后用适量甲醇将提取物充分溶解，过滤，除去不溶物，然后用甲醇定容于100mL容量瓶中。取一定体积的溶液稀释后，用紫外分光光度仪测其紫外吸光度，对照苯甲酸标准曲线求溶液中的总单萜苷的浓度，然后计算总苷量。

1.2.4单萜苷类化合物得率的计算根据标准工作曲线，按照文献［20］方法，通过上述标准曲线求出相当于样品吸光度的苯甲酸的量，按照下式求出总单萜苷的得率：式中：Y为样品中单萜苷得率（%）；m1为根据标准曲线计算出待测液中苯甲酸的质量（mg）；m为待测样品质量（g）；V1为样品提取液测定体积（mL）；V2为样品提取液总体积（mL）。

1.2.5单因素实验设计

1.2.5.1乙醇体积分数对单萜苷得率的影响准确称取5份2.0g凤丹籽饼粉末，分别与40mL体积分数为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇混合，即液料比为20∶1（mL/g），在40℃条件下超声提取30min。离心机离心后，按照1.2.3中的方法配制溶液。用紫外分光光度仪测其紫外吸光度，对照苯甲酸标准曲线求溶液中的单萜苷的浓度，然后计算总单萜苷的量。每个条件均做三组平行实验。

1.2.5.2提取时间对单萜苷得率的影响准确称取2.0g干燥凤丹籽饼粉末5份，按液料比20∶1加入体积分数为50%的乙醇。40℃条件下设置超声提取时间分别为20、25、30、35、40min得到产物。后续步骤同1.2.5.1。

1.2.5.3液料比对单萜苷得率的影响准确称取2.0g凤丹籽饼粉末5份，设置液料比分别为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g），即在上述5份粉末中加入50%的乙醇20、30、40、50、60mL。在40℃条件下超声提取35min。后续步骤同1.2.5.1。

1.2.6Box-Behnken实验设计在单因素实验结果基础上，选取乙醇体积分数、液料比、超声时间3因素3水平的响应面实验。总共进行17次实验，每个实验点重复三次，结果取3次数据的平均值。采用随机化的原则以减少随机误差。因素水平见表1。

表1　响应面实验因素水平表Table 1　Factors and levels of response surface methodology

2　结果与分析

2.1单因素实验结果与分析

2.1.1乙醇体积分数对单萜苷得率的影响由图1可见随着乙醇体积分数的增大，总单萜苷的得率不断升高，当乙醇体积分数达到50%时，凤丹籽中单萜苷化合物得率达到最大为2.056%。乙醇体积分数大于50%后，单萜苷类化合物的得率有所下降，单萜苷得率在1.667%～2.056%之间变化。因此，提取凤丹籽中的单萜苷类化合物时，选用乙醇体积分数为50%最为合适。

图1　乙醇体积分数对总苷得率的影响Fig.1　Effect of ethanol concentration on the extraction rate of monoterpene glycosides

2.1.2提取时间对单萜苷得率的影响由图2可以看出，在提取时间为20～35min时总苷量随提取时间的增加而增大，20～30min时得率变化缓慢，30～35min时得率上升较快。当提取时间大于35min时总苷的得率随时间的增加而减少。因此超声的时间选定为35min。

图2　超声时间对总苷得率的影响Fig.2　Effect of extraction time on the extraction rate of monoterpene glycosides

2.1.3液料比对单萜苷得率的影响由图3可见，15∶1～30∶1时，随着液料比的增加，单萜苷的得率逐渐增加，且在30∶1时达到最大值，为4.645%。因此选取液料比为30∶1（mL/g）进行响应面实验。

2.2Box-Behnken实验设计结果

图3　液料比对总苷得率的影响Fig.3　Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of monoterpene glycosides

表2　响应面分析实验结果与方案Table 2　Box-Behnken experimental design and experimental results for response surface analysis

表3　响应面实验方差分析结果Table 3　Analysis of variance for the fitted regression model

综合单因素实验，选择总苷得率影响显著的超声时间、液料比、乙醇体积分数因素进行响应面研究，响应面分析实验所得结果如表2所示。利用统计软件Design Expert 8对所得数据进行分析，进行回归拟合，得方程为：

Y=2.73-0.068A+0.17B+1.35C-0.49AB-0.52AC+ 0.48BC+0.031A2+0.45B2+0.85C2

模型p=0.0003，表明回归模型达到了极显著水平，失拟项（p=0.6424）不显著，说明回归模型和预测值之间有较好的拟合度，能够正确反映出总苷得率与超声时间、乙醇体积分数、液料比之间的关系。因此，该模型可以用于预测总苷得率的实际情况。

由表3可以看出，模型的一次项C极显著（p＜0.05）；交互项AB、AC、BC显著（p＜0.05）；二次项C2极显著（p＜0.01），B2显著（p＜0.05）。由此可知，自变量和响应值之间不是简单的线性关系。从F值的大小可以看出，三个因素对总苷得率的影响顺序为：C＞B＞A，即超声时间＞液料比＞乙醇体积分数。

根据回归分析结果，做出响应面曲面图4～图6，由图4可以看出，随着超声时间的增大，总苷的得率明显增加，但随着液料比的增大，总苷的得率变化不太明显。由等高线疏密可以看出，沿超声时间移动的密度大于沿乙醇体积分数的密度，表明超声时间对响应面的影响更大。同理得出单因素对总苷得率的影响程度依次为超声时间＞液料比＞体积分数，与F值结果相符。

根据得到的模型，通过软件Design-Expert求解回归方程，得单萜苷的最佳提取条件：超声时间为34.95min，体积分数41.12%，液料比34.95∶1，单萜苷总苷的产率为6.94%，考虑到实际操作将理论组合校正为：超声时间为35min，体积分数41%，液料比35∶1，在该条件下进行验证实验，测定总苷得率为7.089%，说明该模型可靠。

图4　超声时间与乙醇体积分数对总苷得率影响的响应面图Fig.4　Response surface plot showing the interactive effects of extraction time and ethanol concentration on the extraction rate of monoterpene glycosides

图5　液料比与乙醇体积分数对总苷得率影响的响应面图Fig.5　Response surface plot showing the interactive effects of liquid/material ratio and ethanol concentration on the extraction rate of monoterpene glycosides

图6　液料比和超声时间对总苷得率影响的响应面图Fig.6　Response surface plot showing the interactive effects of liquid/material ratio and extraction time on the extraction rate of monoterpene glycosides

3　结论

本研究通过单实验因素和Box-Behnken实验设计及响应面分析法，对超声提取凤丹籽饼粕中的总单萜苷类化合物的工艺进行优化，得到二次多项回归方程数学模型，确定了目标函数与工艺条件之间的关系。各因素对单萜苷得率的影响程度大小依次为：超声时间＞液料比＞乙醇体积分数。经过回归优化后得出的最佳工艺条件为：超声时间35min，乙醇体积分数41%，液料比35∶1（mL/g），在此条件下凤丹籽饼粕中单萜苷总苷的得率为7.089%。

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Response surface optimization of ultrasonic-assisted extraction of total monoterpene glycosides from seed cake of Paeonias ostii

DENG Rui-xue，LI Xiao-fang，LIU Yi-qiong，ZENG Meng，DONG Jun-qing，LIU Pu*
（Henan Engineering Technology Research Center for Funiu Mountain Wild Medicinal Source，Chemical Engineering& Pharmaceutical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

To investigate the optimal extraction conditions of monoterpene glycosides from seed cake of Paeonia ostii under ultrasonic assistance，three extraction parameters including ultrasonic time，ethanol concentration and liquid/material ratio on the extraction rate of monoterpene glycosides were optimized.On the basis of single factor tests，the extraction technology of monoterpene glycosides from the seed cake of Paeonia ostii was optimized by response surface methodology.The optimum conditions obtained were as follows:extraction time was 35min，ethanol concentration was 41%，liquid/material ratio was 35∶1（mL/g）.Under this conditions，the extraction rate values of monoterpene glycosides was 7.089%.

Paeonia ostii；seed cake；monoterpene glycosides；ultrasound assisted extraction；response surface methodology

TS229

B

1002-0306（2015）10-0269-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.048

2014－08－27

邓瑞雪（1978-），女，博士，副教授，研究方向：天然功能食品。

刘普（1978-），男，博士，副教授，研究方向：药用植物资源。

洛阳市科技攻关项目（1301052A，1401074A）。