纳豆菌发酵大豆蛋白制备抑菌发酵液的工艺优化

陈茜，汪建明，*，胡可眉

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津市可美国际贸易有限公司，天津300461）

纳豆菌发酵大豆蛋白制备抑菌发酵液的工艺优化

陈茜1，汪建明1，*，胡可眉2

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津市可美国际贸易有限公司，天津300461）

利用纳豆菌液态发酵大豆分离蛋白，制备含有抑菌物质的发酵液，以大肠杆菌及金黄色葡萄球菌为指示菌，测定不同发酵条件对发酵液抑菌活性的影响。通过单因素及正交实验确定最佳发酵条件，验证实验与正交实验组10对照得出最佳条件为装液量100 mL，发酵时间48 h，发酵温度37℃，接种量12%，pH7.0，制备得到的发酵液对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌抑制效果均较佳，其中对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达到18.5 mm，较空白增加12.5 mm。关键词：纳豆菌；液体发酵；抑菌性；工艺优化

随着致病菌抗药性的提高，开发微生物天然防腐剂成为食品药品防腐研究的热点。目前食品工业中使用的防腐剂大多是化学防腐剂，虽效果显著，但对人体有一定的毒副作用［1］。纳豆菌是20世纪初期由日本学者发现并分离出来的枯草芽孢杆菌的一个亚种［2］，可以分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质，使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种物质，极易被人体所吸收［3］。且纳豆菌代谢能够产生纳豆激酶，酶解蛋白质产生的小分子多肽等代谢产物对细菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌作用，对人体无毒害，可以用来制备天然生物防腐剂［4-5］。

以大豆分离蛋白作为底物制备发酵培养基，研究纳豆菌在不同条件下制备发酵液的抑菌性，通过单因素试验初步确定工艺参数，采用正交试验进行优化，最终确定最佳发酵条件，为大规模生产纳豆菌发酵抑菌液提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大豆分离蛋白：山东德州瑞康食品有限公司提供；纳豆菌剂、大肠杆菌（Escherichia.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：天津科技大学食品工程与生物技术学院提供。

恒温振荡器：金坛市新航仪器厂；AB204-N电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；DHP-781电热恒温培养箱：河北省黄石市医疗机械厂；DGG-101-1电热鼓风干燥箱：天津天宇机电有限公司；立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHJ系列洁净工作台：上海汇龙仪表电子有限责任公司；TDL-5-A台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2方法

1.2.1纳豆菌扩大培养

称取蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，Nacl0.5%于150mL三角瓶，0.1 mol/L NaOH调pH为7.2～7.4，121℃蒸汽灭菌20 min，作为纳豆菌种子培养基［6］。待冷却至室温后，加入纳豆菌粉，37℃摇床培养24 h，直至培养基由澄清变浑浊。

1.2.2发酵培养基的制备

称取大豆分离蛋白6%，无水葡萄糖0.4%，Nacl 0.1%，生长因子Tween-80 0.2%于250 mL三角瓶，调pH为7.2～7.4。

1.2.3发酵液抑菌活性的测定

采用双层平板打孔法对发酵液的抑菌活性进行测定［7］，指示菌选取大肠杆菌（革兰氏阴性）与金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性）。

1.2.4发酵时间对发酵液抑菌性影响

根据1.2.2配制纳豆菌发酵培养基于150mL/250mL三角瓶，加入6%纳豆种子液（体积分数），于35℃、200 r/min的摇床中分别发酵40、44、48、52、56h。发酵液5000r/min离心10 min，上清液通过0.25 μm滤膜除菌体，通过1.2.3双层平板法测定发酵液抑菌性。

1.2.5装液量对发酵液抑菌性影响

根据1.2.2配制纳豆菌发酵培养基于250 mL容量瓶，加水溶解至100、125、150、175、200 mL，加入6%纳豆种子液（体积分数），于200 r/min的摇床中35℃发酵48 h。发酵液5 000 r/min离心10 min，上清液通过0.25 μm滤膜除菌体，通过1.2.3双层平板法分别测定发酵液抑菌性。

1.2.6温度对发酵液抑菌性影响

根据1.2.2配制纳豆菌发酵培养基于150mL/250mL容量瓶，加入6%纳豆种子液（体积分数），置于200r/min的摇床中，分别在30、32、35、37、39℃发酵48h。发酵液5 000r/min离心10min，上清液通过0.25μm滤膜除菌体，通过1.2.3双层平板法分别测定发酵液抑菌性。

1.2.7接种量对发酵液抑菌性影响

根据1.2.2配制纳豆菌发酵培养基于150mL/250mL容量瓶，分别加入纳豆种子液0%、4%、6%、8%、10%、12%、14%（v/v），置于200r/min的摇床中，35℃发酵48 h。发酵液5000r/min离心10min，上清液通过0.25 μm滤膜除菌体，通过1.2.3双层平板法分别测定发酵液抑菌性。

1.2.8pH对发酵液抑菌性影响

根据1.2.2配制纳豆菌发酵培养基于150mL/250mL容量瓶，加入纳豆种子液10%（体积分数），0.1 mol/L Hcl溶液分别调pH为6.7、7、7.2、7.5、7.7，置于200r/min的摇床中，35℃发酵48h。发酵液5000r/min离心10min，上清液通过0.25 μm滤膜除菌体，通过1.2.3双层平板法分别测定发酵液抑菌性。

1.2.9发酵条件优化与验证

根据发酵时间、装液量、发酵温度、接种量、pH的单因素实验结果，选取最佳条件临界区间，设计5因素3水平的正交实验［8］，选取金黄色葡萄球菌作为指示菌进行正交优化实验。因素水平表如表1。

表1　发酵条件优化实验因素水平表Table 1Factors and levels of fermentation condition optimization orthogonal experiment

由方差分析结果确定各因素对实验结果的影响，得到产抑菌物质最佳的发酵工艺条件。在最佳发酵条件下制备发酵液，对其抑菌性进行验证。

2　结果与分析

2.1发酵时间对发酵液抑菌性的影响

实验结果如图1所示，在48 h内，随着发酵时间增加，发酵液的抑菌圈直径变化趋势缓慢，48 h时之后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径有明显增加，在56 h分别达到18.75 mm和18.25 mm。这可能是由于随着发酵时间加长，菌种达到对数生长期，对大豆蛋白的利用率增加积累更多代谢产物。综合生产成本等实际情况选取最佳发酵时间为56 h。

图1　发酵时间对发酵液抑菌性的影响Fig.1Effect of fermentation time on the inhibitory activity

图2　装液量对发酵液抑菌性的影响Fig.2Effect of liquid capacity on the inhibitory activity

2.2装液量对发酵液抑菌性的影响

由图2可知，抑菌圈直径大小随着装液量的减少而减小。当装液量100 mL时，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌圈直径分别为16.5 mm和18 mm。由于纳豆菌为革兰阳性好氧菌，对氧气有一定需要，装液量越小，培养基中溶氧系数高，有利于微生物发酵代谢合成抗菌物质，因此装液量100 mL为菌种最佳生长条件之一。

2.3发酵温度对发酵液抑菌性的影响

发酵温度对发酵液抑菌性的影响见图3。

图3　发酵温度对发酵液抑菌性的影响Fig.3Effect of fermentation temperature on the inhibitory activity

由图3可知，培养基发酵温度在30℃～37℃范围内，发酵液抑菌圈直径逐渐增加，温度在39℃时抑菌圈直径下降明显。温度升高反应速率加大，生长代谢加快，微生物代谢物产量提高，但温度超过一定范围时不适宜微生物生长，产生的酶发生变性或失活，化学反应速率降低，代谢产物减少［9］。且纳豆菌生长温度耐受值是40℃至45℃，温度过高超过菌种产生耐受性孢子，不利于发酵过程的完成。所以最佳发酵温度为37℃。

2.4接种量对发酵液抑菌性的影响

接种量对发酵液抑菌性的影响见图4。

图4　接种量对发酵液抑菌性的影响Fig.4Effect of inoculation quantity on the inhibitory activity

实验结果由图4可以看出，随着接种量增加，发酵液抑菌圈直径也逐渐加大，但接种量超过8%时发酵液抑菌性有降低趋势。这可能是由于微生物生长分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期4个阶段，在一定范围内接种量越大，菌种生长速率越大，代谢产物的产生速度越快，但接种量过大时，一定量的培养基消耗过快，菌种生长竞争力加大，不利于代谢过程和代谢产物的产生，菌种越早步入衰亡期。结合两种指示菌的抑菌性变化趋势，选取8%为最佳接种量。

2.5pH对发酵液抑菌性的影响

pH对发酵液抑菌性的影响见图5。

图5　pH对发酵液抑菌性的影响Fig.5Effect of pH on the inhibitory activity

由图5可以看出，培养基起始pH变化对发酵液抑菌性的影响相对较小。微生物生长环境的pH是影响其生长代谢的条件之一，这是因为pH影响细胞膜表明带电基团和结构，进而影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌［9］。研究表明纳豆菌产抗菌物质的过程中分泌胞外酶，培养基pH在7.0左右对其产酶和分泌胞外酶的能力影响变化较小。

2.6发酵条件优化实验

根据表1进行发酵条件优化实验，利用正交分析软件对结果进行分析，实验结果如表2，方差分析表如表3。

表2　发酵条件优化正交试验结果Table 2Results of fermentation optimization orthogonal experiment

表3　正交试验方差分析Table 3Variance analysis of fermentation optimization orthogonal experiment

由表2正交优化实验表可知，A3B1C3D3E3为最佳组合，即发酵时间56h、装液量100mL、发酵温度37℃、接种量12%、pH 7.2。由表3方差分析可以得出各因素影响作用大小为接种量＞装液量＞发酵时间＞发酵温度＞pH，各因素无显著影响。根据正交实验结果进行验证实验结果如图6所示。

1号孔为空白组生理盐水，2号孔为发酵液，3、4号孔为平行对照。此时大豆蛋白发酵液对金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径为16.5 mm，与空白对照相比增加了10.5 mm。然而与正交实验组10比较可以看出，在A1B1C3D3E2实验条件下，抑菌圈直径为18.5 mm，比验证实验抑菌圈直径大2 mm，所以选取实验组10为最佳发酵条件，即发酵培养基装液量100 mL，接种12%菌液，pH7.0，37℃下发酵培养48 h。

图6　金黄色葡萄球菌的抑菌圈Fig.6Inhibition zone of Staphlococcus aureus

3　结论

通过发酵时间、装液量、发酵温度、接种量和pH的单因素实验结果设计正交试验，对纳豆菌液体发酵大豆蛋白的发酵条件进行优化，得出最佳发酵条件为发酵时间48 h、装液量100 mL、发酵温度37℃、接种量12%、pH 7.0。实验结果表明，在不同条件下制备的发酵液对常见致病菌大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，验证实验以金黄色葡萄球菌作为指示菌，在正交试验结果最佳发酵条件下抑菌圈直径18.5 mm。

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Process Condition Optimization of Bacillus natto Liquid Fermented Soybean Protein for Antibacterial Production

CHEN Xi1，WANG Jian-ming1，*，HU Ke-mei2
（1.Tianjin University of Science and Technology，College of Food Engineering and Biology Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Kemei International Trade Co.，Ltd.，Tianjin 300461，China）

Bacillus natto liquid fermented soybean protein was able to produce liquor with antibacterial material.Determine the antibacterial activity with E.coli and Staphylococcus aureus which are the common pathogenic bacterium in human body.Research the effect of different fermentation condition factors on antibacterial activity and design orthogonal experiment to optimize it.The comparison between confirmatory experiment and experiment NO.10 showed that the best fermentation condition was liquid content 100 mL，fermentation time 48 h，temperature 37℃，inoculation quantity 12%，pH 7.0.In this condition，the inhibition zone of the two indicator bacterium were 18.5 mm，increase 12.5 mm compare with blank group.

Bacillus natto；liquid fermentation；antibacterial activity；processing optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.033

2014-06-16

陈茜（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品工程。

汪建明（1972—），女（汉），教授（博士生导师），博士，研究方向：动植物蛋白的生物功能及应用。